3个酿酒葡萄品种组培快繁体系的建立及优化

杨 波,王 昊,陈永伟,哈 蓉,靳 韦,徐 灿,张 敏,杨桂丽,杨宏波,马文礼

(宁夏农垦农林牧技术推广服务中心,宁夏银川 750000)

0 引 言

【研究意义】葡萄(VitisviniferaL.)属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(VitisL.)落叶木质藤本植物[1]。宁夏贺兰山东麓具有葡萄生长得天独厚的气候环境及地理条件[2,3]。近些年,随着酿酒葡萄产业的规模化生产,宁夏陆续引进紫大夫、梅鹿辄、长相思等酿酒葡萄品种,以期解决酿酒葡萄品种单一与苗木质量参差不齐[4]以及葡萄病毒病发生而限制宁夏葡萄酒产业高质量发展的问题。同时,随着对葡萄酒高品质的要求,对新酿酒葡萄品种的需求日益迫切[5],对长相思、小味儿多和紫大夫等小众葡萄品种苗木的需求也越来越大,较为传统的扦插繁殖虽方便简单易操作,但该方法受品种枝条数量的限制,短期内繁殖的数量有限且苗木常携带病毒,且长期传统的繁殖方法会造成葡萄品种严重退化现象[6]。因此,建立一套适合该品种的组培快繁脱毒体系对快速获得无毒长相思、紫大夫等品种的优质苗木具有重要意义。【前人研究进展】鲜食葡萄阳光玫瑰[7]、红提[8]、黑虎香[9]、夏黑、红地球、玫瑰香、巨峰[10]等均已经建立组培快繁体系,酿酒葡萄品种赤霞珠、蛇龙珠等[11]老品种也均形成了组培快繁体系。但对于多数葡萄品种组培继代培养时,不同品种对于培养基中细胞分裂素的需求不同。刘娜等[12]对赤霞珠、西拉、霞多丽和美乐4个酿酒葡萄品种进行组培快繁,认为半木质化茎段为外植体接种能够提高成活率,且筛选出了适合这4个酿酒葡萄品种最佳启动、增殖和生根培养基;徐美隆等[13]对酿酒葡萄赤霞珠组织培养快繁技术进行了优化;王婷等[14]以蛇龙珠为试验材料,对离体快繁中的启动、增殖培养基的种类和激素用量等关键技术措施进行了研究,筛选出了适于蛇龙珠的最佳组培快繁体系。【本研究切入点】虽然多个酿酒葡萄品种已经建立了组培快繁体系,但由于葡萄品种间存在一定差异,限制了酿酒葡萄的遗传转化等进程,需加大对酿酒葡萄新品种增殖、生根培养及脱毒影响因子的研究,提高其繁殖及脱毒效率。【拟解决的关键问题】以紫大夫、小味儿多和长相思3个酿酒葡萄品种为研究对象,通过研究无菌外植体消毒、启动培养、增殖培养和再生脱毒等环节的关键技术,建立酿酒葡萄组培快繁体系,为酿酒葡萄新品种规模化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2021年在宁夏农垦玉泉营苗木繁育有限公司组培实验室进行,材料取自大棚生长的长相思、紫大夫和小味儿多3个酿酒葡萄品种。

1.2 方 法

1.2.1 外植体的消毒

取生长健壮植株的新生带腋芽茎段(分割成3 cm 左右),在超净工作台上采用不同的消毒方式对茎段进行表面消毒,消毒后用无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干其表面水分,两端分别切除5 mm左右,后接种于相应的启动培养基上,采用3因素3水平的正交试验设计L9(33),每个处理接种20个茎段,3次重复(下同)。观察并统计褐化、污染及成活的外植体数,计算污染率、褐化率及成活率。表1

表1 不同酿酒葡萄品种外植体消毒处理

1.2.2 启动培养基筛选

将消毒处理后的外植体接种于含有不同生长激素的不同培养基中,促其腋芽萌发。茎段离体培养20 d,腋芽萌发情况稳定,观察并统计外植体萌芽数,计算萌芽率。培养条件:温度(25±2)℃,光照强度2 500 lx(下同)。表2

表2 不同酿酒葡萄品种外植体启动培养基

1.2.3 继代培养基筛选

将经初代培养获得的无菌单芽,接种于含有不同植物生长调节剂组合的继代培养基中,诱导不定芽产生,培养60 d,观察并统计每个接种单芽的总芽数,计算增殖系数[15]。表3

表3 不同酿酒葡萄品种继代培养基筛选

1.2.4 生根培养基筛选

将继代培养后的无菌单芽,接种于含有不同植物生长调节剂组合的不同继代培养基中。培养30 d,观察并记录各单株的生根数、根长和根粗,计算生根率及生根综合质量[16]。表4

表4 不同酿酒葡萄品种生根培养基筛选

1.2.5 茎尖结合高温处理脱毒

茎尖结合高温处理脱毒是以7个酿酒葡萄品种黑比诺、桑娇维塞、霞多丽、马尔贝克、长相思、小味儿多、紫大夫为试材,将生长势较好的组培苗转接到生根培养基中,室温条件下培养 15 d左右,待其根长至1～2 cm,株高长至2.5～3 cm,然后将组培苗转移至恒温培养箱中 32℃培养 7 d,再逐渐升温至 38℃,热处理 30 d 后,剥取1 mm茎尖转接到新配制的生根培养基中[6]。生根培养基为:1/2 MS+0.4 mg/L IBA +0.2 mg/L NAA。

将成活后的脱毒葡萄试管苗送往中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心,进行葡萄卷叶病毒 1(GLRaV-1)、葡萄卷叶病毒 3(GLRaV-3)、葡萄卷叶病毒 5(GLRaV-5)、葡萄病毒 A(GVA)、葡萄斑点病毒7(GFkV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)的检测,单样送检植株数量为2瓶。

1.3 数据处理

分别采用 Excel 2007 和 SPSS 17.0 软件进行数据整理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对酿酒葡萄品种外植体污染及成活的影响

研究表明,小味儿多和长相思处理C5的污染率最低,分别为50.00%和37.93%;紫大夫污染率最低的是处理C6和处理C7的62.50%,其次是处理C5的67.75%。处理C5的污染率最低。

小味儿多处理C5的成活率最高,为57.00%;紫大夫成活率最高的是处理C6和处理C7的37.50%,长相思成活率最高的是处理C7的63.64%,其次是处理C5的62.07%。在9个不同消毒处理的组合中,处理C5(10%次氯酸钠,消毒7.5 min;75%乙醇,消毒30 s;0.1%HgCl2,消毒10 min)能够降低消毒后外植体的污染率,提高外植体的成活率。表5

表5 不同处理下3个酿酒葡萄品种外植体成活率变化

2.2 不同处理对酿酒葡萄品种外植体萌芽率的影响

研究表明,以紫大夫品种为例,当培养基为MS培养基时,萌芽率从大到小依次为D2>D3>D1;当培养基为1/2 MS培养基时,萌芽率从大到小依次为D5>D4>D6;当培养基为GS培养基,萌芽率从大到小依次为D8>D7>D9,当培养基相同时,随着激素6-BA的浓度增加萌芽率呈现先增加后降低的趋势,最适激素6-BA的浓度是1.0 mg/L。当激素6-BA的浓度为1.0 mg/L时,萌芽率从大到小依次为D2>D8>D5;当激素6-BA的浓度为1.5 mg/L时,萌芽率从大到小依次为D9>D3>D6,当激素6-BA的浓度相同时,随着激素NAA浓度的增加萌芽率也呈现先增加后降低的趋势,最适激素NAA的浓度是0.1 mg/L。

处理D2(MS培养基,1.0 mg/L 6-BA,0.05 mg/L NAA)更利于外植体萌芽,可以提高大多数酿酒葡萄品种的萌芽率。图1

图1 不同处理下酿酒葡萄品种 外植体萌芽率变化

2.3 不同处理对酿酒葡萄品种继代培养增殖系数的影响

研究表明,不同处理下继代培养基上各酿酒葡萄品种的增殖系数存在一定差异。以小味儿多品种为例,当基础培养基为MS时,增殖系数从大到小依次为处理E3>E2>E1;当基础培养基为1/2MS时,增殖系数从大到小依次为处理E5>E4>E6;当基础培养基为GS时,增殖系数从大到小依次为处理E8>E7>E9,最适的激素6-BA的浓度为1.0 mg/L。当6-BA的浓度为0.5 mg/L时,增殖系数从大到小依次为处理E7>E4>E1;当6-BA的浓度为1.0 mg/L时,增殖系数从大到小依次为处理E5>E8>E2;当6-BA的浓度为1.5 mg/L时,增殖系数从大到小依次为处理E3>E9>E6,最适的激素NAA浓度为0.3 mg/L。其余3个酿酒葡萄品种也均表现为此规律。

处理E5(1/2MS培养基,1.0 mg/L 6-BA,0.3 mg/L IBA)的增殖系数最大,丛生芽增殖效果最佳,适于酿酒葡萄品种丛生芽的增殖培养。图2

图2 不同处理下酿酒葡萄品种 继代培养增殖系数变化

2.4 不同处理对酿酒葡萄品种生根及质量影响

2.4.1 不同处理对酿酒葡萄品种生根的影响

研究表明,培养基种类、IBA浓度和NAA浓度对紫大夫、长相思和小味儿多组培苗的平均生根数有显著影响(P<0.05),对紫大夫和小味儿多的生根率有显著影响,而对长相思的生根率没有显著影响。9个处理的生根率在66.67%～93.33%,其中处理F5的生根率最高,为93.33%,其次是处理F7的90.00%,生根率最低的为处理F1的66.67%;长相思和小味儿多生根率最高的也均为处理F5,分别为93.33%和85.00%。小味儿多平均生根数:9个处理的平均生根数在9.11～21.67条,其中处理F5的平均生根数最多,为21.67条,其次是处理F7的21.44条,处理F8的平均生根数最少为9.11条;紫大夫和长相思的平均生根数也均为处理F5,分别为20.11条和15.83条。处理F5(1/2MS培养基,0.4 mg/L IBA,0.4 mg/L NAA)更利于提高酿酒葡萄组培苗的生根率及生根量。表6

表6 不同处理下酿酒葡萄品种生根变化

2.4.2 不同处理对酿酒葡萄品种生根质量影响

研究表明,9个处理的平均根长在2.03～11.19 cm,其中处理F6的平均根长最长,与其它各处理间差异显著,其次是处理F1,然后是处理F5;9个处理的平均根粗在0.73～1.58 mm,其中处理F2的平均根粗最大,与除处理F1之外的其它处理间差异显著,处理F9的最小。

小味儿多生根综合质量,9个处理的生根综合质量在3.45～7.62,其中处理F5的生根综合质量最大,为7.62,与其它处理间差异显著,其次是处理F7的6.41,生根综合质量最小的为处理F8的3.45;长相思生根综合质量在2.62～6.34,处理F5的生根综合质量最高,为6.34,最小的为处理F4的2.62。处理F5(1/2MS培养基,0.4 mg/L IBA,0.4 mg/L NAA)更利于提高酿酒葡萄组培苗的生根综合质量。表7

2.5 酿酒葡萄品种热处理及茎尖脱毒结果

研究表明,送检的7个酿酒葡萄品种均不含葡萄卷叶病毒 1(GLRaV-1)、葡萄卷叶病毒 3(GLRaV-3)、葡萄卷叶病毒 5(GLRaV-5)、葡萄斑点病毒7(GFkV)和葡萄扇叶病毒(GFLV);但7个品种组培苗中黑比诺、桑娇维塞、霞多丽、马尔贝克和长相思均含有葡萄病毒 A(GVA),小味儿多和紫大夫不含葡萄病毒 A(GVA),7个酿酒葡萄品种对葡萄病毒 A的脱毒率仅为28.57%,茎尖处理结合热处理对葡萄病毒 A的脱毒效果一般。表8

3 讨 论

3.1酿酒葡萄品种紫大夫、小味儿多和长相思在宁夏贺兰山东麓较高的适应性[17]。对葡萄组织培养的外植体消毒试剂最常见的有乙醇、氯化汞、次氯酸钠和双氧水[1]。胡文斌等[18]试验结果认为70%乙醇处理30 s和0.1%氯化汞消毒8 min对红地球葡萄的外植体消毒是最佳组合;陈玉霞等[19]认为以0.1%氯化汞消毒9 min对3个葡萄新品种的外植体消毒最佳,无菌苗获得率为45.10%～60. 00%,试验得出当用10%次氯酸钠消毒7.5 min,75%乙醇消毒30 s,0.1%氯化汞消毒10 min是最佳的消毒组合,与其他研究结果略有不同,消毒试剂的不同组合及消毒时间是影响葡萄外植体成活率和减少外植体污染的关键。

3.2刘晓芹等[20]研究认为对葡萄砧木3309、101-14 mgt和rup的最适启动培养基为1/2MS+0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA,试验结果表明,添加1.0 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA的MS培养基是培养长相思等品种的最佳启动培养基,不同葡萄品种所需的启动培养基具有一定特异性。其次,培养基内的营养物质直接影响葡萄组培苗的增殖及生根,植物激素作为活性物质能够调控植物生长,在细胞分裂、组织分化及离体组织培养等方面均有重要作用[21],且一定浓度的细胞分裂素和生长素对诱导不定芽发生具有积极意义。苏玲等[22]研究表明,MS和1/2MS培养基中加入1.0 mg/L 6-BA时外植体增值系数高,但当 6-BA的浓度增大为2.0 mg/L时外植体易出现畸形,因此在开展葡萄组培过程中要筛选适宜的培养基和激素浓度,才利于外植体的增殖,试验结果表明添加1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA的1/2MS培养基是最利于长相思等品种外植体增殖的培养基。其次研究表明,一定浓度的生长素IBA能够提高葡萄组培苗的生根效率和生根质量,林茜等[7]研究认为1/2 MS+0.4 mg/L IBA +0.2 mg/L NAA是培养阳光玫瑰葡萄的最佳培养基;冯文华等[11]认为在1/2MS培养基中添加0.2 mg/L的IBA既可以扩繁增殖又可生根壮苗;而试验所筛选的最佳生根培养基为添加0.4 mg/L IBA和0.4 mg/L NAA的1/2MS培养基,说明不同品种所需要的内源激素浓度有一定的差异性。齐永顺等[23]研究表明,在生根诱导过程中,内源激素IAA、ABA 等均可以调控根的伸长、加粗。葡萄病毒的脱毒方法包括微茎尖培养、热处理结合茎尖培养、化学试剂结合茎尖培养和超低温等,最常见的脱毒方法为热处理结合茎尖培养,效果最佳的脱毒方法为超低温结合茎尖培养,但成活率较低[1],研究以热处理结合茎尖对7个酿酒葡萄进行了脱毒处理,结果显示剥取茎尖1 mm,在38℃温度下热处理 30 d ,在选择添加0.4 mg/LIBA 和0.2 mg/L NAA 的1/2 MS培养基中培养,能够脱除绝大部分葡萄病毒,与张尊平等[24]的研究结果一致,认为在38℃温度下组培苗培养30 d,对葡萄卷叶病毒1和葡萄斑点病毒等6种病毒的脱除效果较好。

4 结 论

建立了3个酿酒葡萄品种的组培快繁及脱毒技术体系。以幼嫩的腋芽为消毒试材,当用10%次氯酸钠消毒7.5 min,75%乙醇消毒30 s,0.1%氯化汞消毒10 min能够降低消毒后外植体的污染率,提高外植体的成活率;启动培养基可选择MS培养基,加入1.0 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA更利于外植体萌芽,可以提高大多数酿酒葡萄品种的萌芽率;1/2MS培养基作为增殖培养基,加入1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA,其丛生芽增殖效果最佳,适于酿酒葡萄品种丛生芽的增殖培养;生根培养基为1/2MS培养基,加0.4 mg/L IBA和0.4 mg/L NAA,更利于提高酿酒葡萄组培苗的生根综合质量;脱毒剥取茎尖选择1 mm,热处理温度选择38℃,热处理 30 d,培养基为1/2 MS培养基,加0.4 mg/L IBA 和0.2 mg/L NAA,能够脱除绝大部分葡萄病毒。整个组培繁殖脱毒体系基本适用于 3个酿酒葡萄品种的繁育及脱毒。