基于网络药理学和分子对接技术探究脑络欣通治疗缺血性脑卒中的机制

李佩佩,刘 佳,郜 峦,吴元洁,胡建鹏

(1.安徽中医药大学中医学院,安徽 合肥 230012;2.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012)

缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS),是指脑供血动脉狭窄或闭塞导致组织缺血低氧、坏死的一种破坏性脑血管事件,现已成为中国居民死亡的主要原因之一[1]。现代医学治疗IS主要有静脉溶栓、动脉取栓以及神经保护等手段,虽取得较大的进展,但难以避免缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤以及出血等不良反应[2]。IS属中医学“中风”范畴,益气活血方脑络欣通是新安医家王乐匋基于“气血—脑髓”理论创制的辨治“中风”的特色方剂,该方以黄芪为君,益气扶正以帅血;川芎、三七为臣,活血通脉以载气;以天麻、蜈蚣为佐,息风通络;当归、红花为使,增强活血之力。全方共奏益气活血通络之功,临床适用于气虚血瘀型“中风”[3]。前期研究[4-5]结果表明,脑络欣通能显著改善IS患者血液流变学和神经功能缺损的情况,并能减轻脑缺血大鼠氧化应激、炎症反应等,但其药理机制尚未被完全阐明。因此,本研究基于网络药理学的研究方法,对脑络欣通治疗IS的有效成分与潜在作用机制进行挖掘,并结合分子对接技术从微观角度对其主要成分与核心靶点进行验证,以期为后续实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分及作用靶点筛选 通过中医药系统药理学平台(TCMSP,https://tcmspw.com)、ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index)及化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn)检索7味中药所含的化学成分,限制条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug like,DL)值≥0.18,对不能直接获取OB和DL值的化合物则通过SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch)进行预测并基于Lipinski原则进行筛选[6],同时结合文献补充有效化合物。将符合条件的活性成分导入TCMSP和Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch)获取作用靶点,通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)转换成对应的靶点基因名称(人源)。

1.2 疾病靶点收集 以“ischemic stroke”“cerebral ischemia stroke”“cerebral infarction”为关键词,分别从OMIM(http://www.omim.org)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/home),GeneCards(https://www.genecards.org)、Drugbank(https://www.drugbank.ca)数据库检索关于IS的人类疾病靶点。然后将“1.1”项下获得的靶点与疾病靶点通过Venny 2.1.0在线工具进行映射,取交集基因,即得到脑络欣通治疗IS的潜在作用靶点(共有靶点)。

1.3 蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及关键靶点的查找 将“1.2”项下获得的共有靶点输入STRING平台(https://cn.string-db.org),下载“tsv”格式的蛋白互作关系文件,导入Cytoscape 3.8.2软件,绘制PPI网络。利用CytoNCA插件功能进行拓扑分析,根据节点的连接度(Degree)、介度(Betweenness)、紧密度(Closeness)参数值筛选核心靶点,并构建“中药—活性成分—核心靶点—疾病”网络。

1.4 基因本体(gene ontology,GO)功能与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomics,KEGG)通路富集分析 基于R3.6.2软件中“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”功能包对共有靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。根据P值由小到大排列,采用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)将排名前10位的GO功能[生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC)]3个模块绘制条形图,并将排名前20位的KEGG生物途径绘制气泡图。

1.5 MCODE模块聚类分析 通过Cytoscape 3.8.2软件中MCODE插件对脑络欣通治疗IS的共有靶点进行聚类分析,提取关键的子模块,并参照“1.4”项进行GO-BP分析。

1.6 分子对接验证 通过PDB数据库(https://www.pdbus.org)下载核心靶点的晶体结构,利用PyMOL软件进行去水、删除配体等处理,导出PDB格式文件;同时检索PubChem数据库下载关键成分的“SDF”格式文件,导入Chem3D软件中使其能量最小化,输出PDB格式文件。借助Auto Dock Tools软件对蛋白进行加氢、计算电荷数后保存,根据蛋白原配体位置设置分子对接活性口袋、Lamarckiam GA(4.2)算法进行虚拟对接[7]。PyMOL软件实现对接最优结果可视化。

2 结果

2.1 脑络欣通的活性成分及其作用靶点 通过多数据库联合及文献筛选脑络欣通的活性成分,分别得到黄芪24个,川芎10个,三七16个,天麻11个,蜈蚣6个,红花20个,当归5个,去除重复值后共得到78个活性成分,相应获得靶点蛋白1 316个,经Uniprot数据库标准化后去除无效和重复靶点,得到作用靶点538个。

2.2 脑络欣通治疗IS的潜在作用靶点 通过检索4个数据库共得到IS相关靶点1 089个。将活性成分作用靶点与疾病靶点进行映射,获得共有靶点200个,即为脑络欣通治疗IS的潜在作用靶点,见图1。

2.3 脑络欣通治疗IS的PPI网络及核心靶点的筛选 脑络欣通治疗IS的初步PPI网络图见图2A,共161个节点和789条边,经拓扑分析后得到Degree、Betweenness、Closeness 3项参数的中位数分别为6、66.82、0.094,筛选3项同时在中位数以上的靶点作为核心靶点,共得到59个核心靶点,其中STAT3、JUN、MAPK1、RELA、TP53、PIK3R1、AKT1等排名靠前。将核心靶点按照Degree值构建PPI网络,结果见图2B。

图2 脑络欣通—IS共同靶点PPI图(A)和关键靶点PPI图(B)

2.4 “中药—活性成分—核心靶点—疾病”网络拓扑图及可视化分析 借助Cytoscape 3.8.2软件构建脑络欣通与IS的“中药—活性成分—核心靶点—疾病”网络图(见图3)。网络中有527个节点,每个节点的Degree值表示网络中与节点连线的总条数,Degree值越大表示该化合物发挥作用的可能性越大[8]。对网络图进行拓扑学分析,Degree值排名前10的结果见表1,其可能为治疗IS的关键化合物。由图3可知,脑络欣通中多个中药活性成分协同作用于多个靶点,如黄芪、红花共同成分山柰酚(kaempferol)与红花、蜈蚣共同成分β-胡萝卜素(beta-carotene)共同作用于靶点BCL2、JUN、CASP3,反映了复方多成分、多靶点配伍发挥协同效应的特点。

表1 脑络欣通活性成分连接度Degree值排名

注:倒三角形表示药物;正六边形表示化合物;正八边形表示疾病;菱形表示靶蛋白

2.5 GO富集分析和KEGG注释分析 GO富集分析共得到BP 2 982条、MF 256条、CC 134条,根据显著性选取排列前10的条目绘制条形图(见图4)。结果显示,BP主要涉及药物反应、脂多糖反应、氧化应激等;MF主要涉及DNA结合、转录因子结合、细胞因子受体结合等;CC主要涉及膜筏、膜微区、突触前膜的组成部分、神经元胞体等。

图4 BP、MF和CC中排名前10的条目

通过KEGG注释分析共得到150条信号通路(P<0.05)。选取前20条通路,绘制气泡图,count表示富集在该通路上的靶点数目,见图5。结果显示,脑络欣通可能作用的信号通路包括PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路以及神经营养蛋白信号通路等。

图5 KEGG通路富集分析气泡图

2.6 MCODE聚类分析 通过Cytoscape 3.8.2软件中MCODE插件对200个共有靶点进行聚类,图6为评分前3的子模块可视化图,评分越高,该模块在整个PPI网络中发挥的作用越大。GO的BP分析结果见表2。模块A主要参与对细胞死亡的正调控;模块B主要参与对细胞迁移、运动的正调控;模块C主要参与对转移酶和蛋白质磷酸化的正调控。

表2 不同模块的生物分析过程结果(前3)

图6 共有靶点聚类结果评分前3的模块可视化图

2.7 活性成分和核心靶点的分子对接验证 选取PPI网络中的关键靶点与排名前3的活性成分进行对接,最低结合能(affinity)结果见表3。通过affinity评估对接结果,一般认为affinity<-4.25 kcal/mol表示成分与受体蛋白之间有一定的结合活性,affinity<-5.0 kcal/mol表示二者之间有较好的结合能力,而affinity<-7 kcal/mol则表明二者之间有强烈的结合活性[7]。结果表明,槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚与STAT3、JUN、MAPK1之间均有较好的结合活性。用PyMOL软件对部分对接结果进行可视化分析,可见槲皮素能稳定地对接到STAT3蛋白的活性口袋中,二者通过氨基酸残基ASP-369、LEU-438、LYS-370和ARG-379发挥氢键作用;山柰酚能稳定地对接到JUN蛋白的活性口袋中,二者通过氨基酸残基ASN-42、LYS-122和ASP-215发挥氢键作用;β-谷甾醇能稳定地对接到MAPK1蛋白的活性口袋中,二者通过氨基酸残基ASP-165发挥氢键作用。见图7。

表3 脑络欣通活性成分与核心靶点分子对接最低结合能

注:A.槲皮素(quercetin)与STAT3对接;B.山柰酚(kaempferol)与JUN对接;C. β-谷甾醇(β-sitosterol)与MAPK1对接

3 讨论

本研究确定了脑络欣通中的槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素和豆甾醇等活性成分可能为治疗IS的关键化合物。现代药理学研究[9]表明,槲皮素具有抗氧化、抗炎以及清除自由基等多种生物活性,其通过调控PINK1/parkin通路蛋白的表达,激活线粒体自噬,抑制脑缺血损伤大鼠氧化应激及炎症损伤,发挥神经保护效应;同时槲皮素可以减缓机体凝血过程,通过抑制血小板活化和炎症因子的释放,防止血液凝固[10]。山柰酚是一种多酚类抗氧化剂,可以显著降低活性氧、超氧化物歧化酶、炎症因子的表达,在IS中发挥积极作用[11]。β-谷甾醇和豆甾醇是三七、红花、天麻、当归的共有成分,同属于固醇类化合物,研究[12]证明二者可以通过抗炎、抗氧化、抗凝等作用,减轻脑缺血再灌注损伤。木犀草素为红花主要成分,能够抑制脑缺血再灌注损伤后氧化应激、炎症反应,其机制可能与抑制动力相关蛋白1活性改善自噬流过程,升高热休克蛋白70表达水平,降低脑组织皮质区TNF受体关联因子表达水平有关[13]。以上结果提示,脑络欣通活性成分可能通过参与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及自噬等途径在脑缺血中发挥作用。

基于PPI网络及拓扑参数的分析,筛选出脑络欣通治疗IS的核心靶点,包括STAT3、JUN、MAPK1、TP53、AKT1、PIK3R1等,这些靶点与缺血性疾病密切相关。STAT3是信号转导与转录激活因子3,磷酸化激活后可响应细胞质中不同细胞因子、生长因子信号,进而影响许多生理过程,包括细胞增殖、凋亡、分化等[14]。有研究[15]表明,在大鼠大脑中动脉阻塞模型中观察到缺血区神经元和星形胶质细胞中STAT3显著活化,调控JAK2/STAT3信号通路可以影响神经元、血管内皮细胞的凋亡、增殖和分化,还增加神经可塑性。血管内皮细胞损伤是脑缺血损害的基本动因,而TP53高表达是促进血管内皮细胞凋亡的重要原因之一。研究[16]表明,TP53可以提高内皮细胞Bax的表达,同时降低Bcl-2的表达水平。炎症是IS损伤的关键驱动因素,JUN是核转录因子激活蛋白-1的成员,在生物体内通过多种途径激活炎症反应、应激诱导因子或病原体,与IS的发生发展密切相关[17]。MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶信号通路中关键激酶,脑缺血会导致MAPK1时间依赖性活化,抑制MAPK1能减轻细胞凋亡和炎症反应,对脑卒中小鼠发挥保护作用[18]。PIK3R1是PI3K的p85调节亚基,AKT1是AKT激酶家族的一员,二者通过调控细胞代谢、增殖等多种生物过程参与IS的治疗[19]。研究[20]证实,激活PI3K、AKT可促进内皮细胞生长、迁移,促进血管生成。因此,脑络欣通可能通过作用于STAT3、TP5减轻IS的细胞凋亡;作用于JUN、MAPK1减轻IS的炎症反应;作用于PIK3R1、AKT1促进血管生成,改善IS的血液供应和营养支持。

GO富集的分子功能主要包括药物反应、脂多糖反应、氧化应激等;氧化应激是缺血再灌注过程中导致神经元损伤的关键机制之一,通过损害线粒体ATP的产生并诱导细胞内Ca2+超载和ROS的产生,进而诱导细胞凋亡或坏死[21]。KEGG富集结果显示,脑络欣通治疗IS主要涉及PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路等。PI3K-AKT信号通路是细胞代谢、生长、凋亡等生理活动的经典通路[22]。研究[23]显示,该通路在IS发生发展和药物干预治疗中发挥关键作用,可通过抑制氧化应激、神经元自噬、血脑屏障紊乱等多种病理过程发挥神经保护作用。当组织缺血、低氧时HIF-1蛋白水平迅速升高,调控诱导型一氧化氮合酶、血管内皮生长因子等下游靶基因促进血液循环、葡萄糖运输以及血管新生等,起到对低氧组织的保护作用[24];但HIF-1在低氧组织中的过表达并不一定发挥保护效应。有研究[25]显示,大鼠脑缺血损伤后HIF-1上调导致血脑屏障破坏、水肿程度加重等,具有双重作用。前期研究[26-27]结果表明,脑络欣通能通过调节PI3K-AKT和HIF-1信号通路抑制脑缺血大鼠细胞凋亡,促进血管新生,发挥神经保护作用,与预测结果相符合。此外,FoxO信号通路也是调控细胞增殖、凋亡和代谢等生命过程的重要通路,包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6 4个家族成员,其中FoxO1主要在氧化应激中调控细胞凋亡,FoxO3a在脑缺血中异常表达促进神经元自噬,而下调FoxO4能增加氧化应激时内皮细胞耐受,促进存活[28]。另外,本研究中笔者运用MCODE插件对200个共有靶点进行聚类分析,发现在共有靶点PPI网络中发挥关键作用的子模块主要参与细胞死亡、生长、运动和蛋白磷酸化等生物过程。

综上所述,脑络欣通可能通过槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等活性成分,协同作用于STAT3、JUN、MAPK1等靶点,通过PI3K-AKT、HIF-1、FoxO等信号通路调控氧化应激、神经炎症、细胞凋亡等生物过程,发挥对IS的治疗作用。分子对接结果也证实脑络欣通主要活性成分能与核心靶点之间稳定结合形成氢键。本研究初步揭示了脑络欣通通过多成分、多靶点、多途径治疗IS的作用机制,但值得注意的是,有学者提出“槲皮素类现象”[29],即槲皮素类成分频繁出现在网络药理学研究结果中,可能与其在植物中广泛分布,且各种体内外药效作用报道出现较多有关,此现象需引起重视,后续仍要结合体内外实验验证其网络作用靶点和药效机制。