激素和糖分对暗紫贝母生根培养的影响

字胡润，赵艳娟，管世超，苏娟，文凤，张玉蓉，王晓，李靖瑞，岳健，*

(1.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650506；2.云南山里红生物科技有限公司，云南 昆明 650229)

贝母属(FritillariaL.)属于百合科(Liliaceae)，为多年生草本植物。据记载，该属约有130种，广泛分布于北半球的欧、亚及北美洲的温带地区，尤以地中海北岸、伊朗、土耳其等地区分布的种类最为丰富。我国贝母属植物约有近50个种类、19个变种，主要分布于四川、新疆、甘肃、湖北、安徽、浙江等地[1-2]。2020版《中国药典》中收载的药材贝母就有5大类，分别为川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)、平贝母(FritillariaussuriensisMaxim.)、浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)、伊贝母(FritillariapallidifloraSchrenk)和湖北贝母(FritillariahupehensisHsiaoet K. C. Hsia)，主要以干燥鳞茎入药，味辛、性平，具有清热润肺、化痰止咳等功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，痰中带血，瘵病，乳痈，肺痈等症状[3]。贝母属植物始载于春秋时期的《诗经》[4]，而其应用历史悠久[5]，临床最早记载于东汉张仲景的《伤寒杂病论》，是传统的止咳良药。研究[6-8]表明，贝母主要药用成分为生物碱类、皂苷类萜类、甾体和多糖成分等，具有镇咳、祛痰、降血压、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化、抗菌、提高免疫力、防治阿尔茨海默病等神经病变等功效；其应用广泛，既可用于中医临床止咳祛痰，也可作为清咽润喉保健食品的原料药之一[9]，具有优良的药用价值及营养价值，在未来市场上具有广阔的开发前景。

传统贝母药材以川贝母的药用价值最高，被誉为“止咳圣药”[10]，是国家卫生健康委员会公布的可用于保健食品的中药，具有广阔的开发价值。目前，市场上已经有超过350种川贝母中成药[11]，但主要依赖野生资源，随着需求量的增多，人为过度采挖，加上川贝母在野外状态下种子成熟率和发芽率较低，导致川贝母野生资源越来越少[12]。李西文[13]研究发现，川贝母野生分布面积持续减少。方清茂等[14]研究表明，2020年川贝母市场年需求量在600 t以上，而野生川贝母的年产量不到100 t。川贝母的发展趋势将走向人工抚育与栽培，且随着其栽培技术的日益成熟，栽培品已逐渐走向市场，川贝母的主要货源也逐渐由野生转为栽培[15]。《中国药典》2010年版中，川贝母性状分类新增“栽培品”，也说明川贝母的野生资源枯竭，需要使用栽培品来作为新的替代品或补充品，缓解持续增加的市场需求[16-17]。利用植物组织培养技术可在短期内获得大量性状一致的优良川贝母种苗，有望解决人工种植贝母生长周期长、繁殖系数低的问题[18]。近年来，关于川贝母的研究进展迅速，在生理生态习性、药用有效成分、药理活性及其作用、分子生物学研究等方面取得了较大突破[17-19]。但是，目前对川贝母以及基原植物暗紫贝母的组培繁育仍然处于小规模研究阶段。本文通过研究激素和糖分对暗紫贝母生根培养的影响，为以后暗紫贝母建立组培快繁体系，大规模标准化生产优良暗紫贝母种苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取云南青谷生物科技有限公司种苗培养室苗龄为90 d的暗紫贝母芽繁苗，苗的长势正常，鳞片为白色，不长根。

1.2 研究方法

1.2.1 培养基制备

每个配方配制1 L培养基，每瓶灌装50 mL，每个配方灌装20瓶，培养基的pH值为5.8，灌装好后放入灭菌锅内，温度保持在122 ℃，灭菌30 min后取出培养基放入预培养室5～7 d，选取稳定无污染的合格培养基备用。

1.2.2 接种前材料准备

用干净的报纸包好已洗干净的接种盘，每包5～7个接种盘，放入高压蒸汽灭菌锅内，温度保持在122 ℃，灭菌30 min后取出接种盘放入预培养室，备用。

1.2.3 接种方法

在超净工作台内，将提前选取好的健康无污染的暗紫贝母芽繁瓶苗用喷过酒精的干净毛巾仔细擦拭一遍，然后打开盖子，用已灭菌的镊子取出暗紫贝母芽繁苗放入准备好的灭菌接种盘内，左手拿已灭菌的镊子夹住接种盘内的暗紫贝母，右手拿已灭菌的手术刀去除暗紫贝母苗基部坏死或发黑的部分，确保新鲜健康的植株直接接触培养基，有叶片的用手术刀切去叶片后，用无菌镊子将处理好的暗紫贝母芽繁苗接种到提前配制好的生根培养基中，每瓶培养基转接10棵苗。

1.2.4 不同激素处理对暗紫贝母生根的影响

以全量基本培养基(MS)和添加9.4 g·L-1卡拉胶(car)为基础培养基，添加不同浓度的萘乙酸(NAA)(0.3、0.5、1 mL·L-1)，以及在添加0.5 mL·L-1NAA的基础上加入不同浓度吲哚丁酸(IBA)(0.5、1 mL·L-1)设计实验处理(表1)。每个处理组各6瓶，将转接好的瓶苗盖好盖子，打上标签，放入培养条件为光照2 500 lx、湿度30%、温度(20±1)℃的培养室进行培养，培养90 d后观察暗紫贝母苗生根情况，并统计暗紫贝母苗生根率、生根数量及污染率。

表1 不同处理的培养基配方Table 1 Media formulations for different treatments

1.2.5 不同浓度糖分对暗紫贝母生根的影响

以全量MS培养基和添加9.4 g·L-1car、0.5 mL·L-1NAA以及0.5 mL·L-1IBA为生根培养基，添加不同浓度的糖分(20、30、30 g·L-1)设计实验处理组(表1)。每个处理组各6瓶，将转接好的瓶苗盖好盖子，打上标签，放入培养条件为光照2 500 lx、湿度30%、温度(20±1)℃的培养室进行培养，培养90 d后观察暗紫贝母苗生根情况，并统计暗紫贝母苗生根率、生根数量及污染率。

2 结果与分析

2.1 不同激素及浓度对暗紫贝母生根的影响

在培养90 d后，不同激素及浓度对暗紫贝母生根的影响见表2。不同激素种类和浓度配比对暗紫贝母的诱导生根有显著影响，在MS培养基中，随着NAA质量浓度升高，暗紫贝母无菌苗的生根率也上升，NAA浓度为1.0 mL·L-1时生根率高达76.3%，根生长良好，相对粗壮，平均有效根数有2.8条。但NAA浓度为0.5和1.0 mL·L-1时，暗紫贝母生根率差异不大，与NAA浓度为0.3 mL·L-1时差异明显，说明NAA在较高浓度时有益于生根。在添加0.5 mL·L-1NAA的基础上加入不同浓度的IBA，暗紫贝母的生根率也有提高，生根率在81%以上，平均有效根数在3.2条以上，并且没有出现污染，但是高浓度的IBA导致暗紫贝母根系膨大易脱落，不利于暗紫贝母植株生长。因此，以MS培养基和添加9.4 g·L-1car为基础培养基时，添加0.5 mL·L-1NAA和0.5 mL·L-1IBA时最适合暗紫贝母生根培养，生根率高达81.3%，平均有效根在3.4条，根系生长良好粗壮。

表2 不同处理对暗紫贝母幼苗生根的影响Table 2 Effects of different treatments on the rooting of Fritilaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia seedlings

2.2 不同糖分含量对暗紫贝母生根的影响

在培养90 d后，不同糖分含量对暗紫贝母生根的影响见表3。糖分含量对暗紫贝母生根影响不显著，其生根率均在60%以上，暗紫贝母芽繁苗在蔗糖添加量为30 g·L-1时生根率最好，在80%以上，根系生长情况也好。但是暗紫贝母芽繁苗在添加高糖分含量的培养基中污染率高，在添加了40 g·L-1糖分时污染率高达10%，生根率仅为60.8%，根系生长也细弱。添加高蔗糖含量的培养瓶中暗紫贝母幼苗有增殖的迹象，表明糖分可能也是影响暗紫贝母增殖的关键因素之一，但具体情况还需要进一步验证。

表3 蔗糖对暗紫贝母幼苗生根的影响Table 3 Effect of sucrose on rooting of Fritilaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia seedlings

3 结论与讨论

外源激素的种类、含量以及不同配比在植物组织培养中起着非常重要的作用[20]。生长素类激素主要促进细胞伸长、诱导愈伤组织产生，以及试管苗的生根[21]。进行暗紫贝母无菌苗的生根培养是其组织培养过程中的重要环节，是快速繁殖暗紫贝母种苗的有力保证。本研究表明，在培养基中添加不同激素时，暗紫贝母芽繁苗均能诱导生根，但是不同的激素种类和浓度配比对暗紫贝母的诱导生根有显著影响，当添加0.5 mL·L-1NAA和0.5 mL·L-1IBA时暗紫贝母生根情况最好，生根率高达81.3%，根系粗壮，且有效根数最多，平均每株暗紫贝母有3.4条根系。这是因为激素NAA和IBA对暗紫贝母生根有促进作用。张振霞等[22]的研究结果表明，暗紫贝母鳞茎在1/2 MS生根培养基中，NAA和IBA的存在有利于生根，特别是在含0.5 mg·L-1NAA的培养基中，鳞茎生根密集，长势好。王跃华等[20]将分化出的川贝母无根苗接入生根培养基中诱导生根，发现NAA诱导生根率高达83.20%，而IBA诱导生根率为64.22%。江明殊等[23]的研究结果表明，NAA与IBA相结合有利于根的生长，而不同浓度的NAA与IBA组合对川贝母鳞茎芽生根的诱导影响不同。同时众多研究表明，暗紫贝母无根苗的生根阶段不仅要诱导其生根，还要促进其结鳞茎，马吉义[24]的研究表明，糖明显促进暗紫贝母无根苗生根结鳞茎，糖浓度越高所结的鳞茎越大。但是本研究表明，糖分浓度对暗紫贝母生根影响不显著，生根率都在60%以上，暗紫贝母幼苗在高糖分含量的培养基中诱导生根时污染率较高，根系生长情况相对较差。综上所述，本研究发现暗紫贝母的最适生根培养基为MS+9.4 g·L-1car+0.5 mL·L-1NAA+0.5 mL·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖。

目前，暗紫贝母已经成为了国家重点保护野生药材，其野生资源逐年递减，人工种植暗紫贝母能产生巨大的社会价值和经济效益，然而暗紫贝母优良种苗的繁育是暗紫贝母规范化栽培的“源头工程”[25]。该研究有利于后期建立暗紫贝母建立组培快繁体系，助力暗紫贝母的种苗繁育产业化发展。