烟草抗感南方根结线虫品种根部差异表达mRNA的PPI网络分析

陈小翔，张文军，翟争光，徐志强，刘化冰，钟永健，江智敏*

(1.浙江中烟工业有限责任公司 技术开发分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省烟草公司 长沙市公司，湖南 长沙 410000)

烟草根结线虫病是世界各国烟草生产中的主要病害之一，尤其以南方根结线虫危害为重，给我国的烟草产业造成了巨大损失[1-3]，仅云南省发病面积就达到266.67 hm2，病毒造成烟叶减产达到30%～50%[4]。南方根结线虫病不仅能直接对烟草造成危害，使烟株萎蔫黄化，整株死亡，还会导致烟草青枯病、黑胫病、根黑腐病、镰孢根腐病等病害的发生，从而降低了烟草品种的抗病性[5]。

受环境和经济因素的影响，我国大部分烟区无法采用水旱轮作的方式，选择化学防治的方式，虽然见效快，但也导致了农药的残留，进而导致烟叶品质的下降。化学防治还会引起环境污染，不符合当代“绿色农业”的理念。不同烟草品种之间存在明显的抗性差异，选育抗病品种是防治根结线虫病最有效的方法[6]。

目前，关于南方根结线虫病发病机制的相关研究有很多，一些植物中的抗性基因已经被鉴定和定位，例如：番茄中的Mi基因[7]和辣椒中的Me基因[8]。但是有关烟草相关的抗性基因并未有相关的报道，不同抗性烟草品种之间差异很大，探索抗南方根结线虫的分子机制有利于加强抗性基因的育种工作。关于不同烟草品种抗根结线虫感染机制的生物信息学研究甚少。转录组测序已经用于研究模型和非模型物种等相关方面，例如：数据表达的准确性、动态范围的检测能力、新基因的探索能力等，具有比微阵列分析更显著的优势[9]。因此，本研究以抗病品种K326与感病品种长脖黄为材料[10-11]，在前期转录组测序数据基础上，进行相关生物信息学研究，通过对两种不同烟草品种进行差异表达基因分析，以深入阐述抗根结线虫烟草品种抗感染的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本文所选用烟草(Nicotianatabacum)品种为K326(抗南方根结线虫)和长脖黄(感南方根结线虫)。

1.2 试验方法

利用赛默飞RNA提取试剂盒提取烟苗叶片总RNA，样品检验合格后，进行mRNA的富集及cDNA文库的构建，利用Illumina测序技术进行转录组测序。

1.3 数据处理

1.3.1 转录组数据分析

利用Cytoscape version.3.5.0软件对烟草生物学过程GO分类和KEGG 通路富集进行分析。

1.3.2 PPI网络分析

利用最新的多功能在线软件NetworkAnalyst对南方根结线虫侵染后烟草品种根部的DEGs进行分析，构建可视化的PPI网络，并通过该软件来实现路径和模块之间的探索分析以及蛋白质—蛋白质相互作用。

1.3.3 PPI网络与GO分类综合分析

将PPI网络中分析出的重要基因与GO分类分析出的重要基因进行综合分析，找出引起抗南方根结线虫烟草与感南方根结线虫烟草品种差异表达的重要基因与通路。

2 结果与分析

2.1 差异表达基因的GO功能分类分析结果

通过对GO功能分类分析，共筛选出474个显著富集的通路，表1是GO功能(BP)分类中的差异基因显著富集前9的通路，分别是regulation of cellular metabolic process(细胞代谢)，endosomal transport(胞内体转运)，jasmonic acid mediated signaling pathway(茉莉酸介导的信号通路)，heterocycle metabolic process(杂环代谢)，gene silencing by RNA (RNA介导的基因沉默)，innate immune response(固有免疫应答)，sugar mediated signaling pathway (糖介导的信号通路)，hormone mediated signaling pathway(激素介导的信号通路)，response to salt stress(盐胁迫应答)等，其中重要基因有：Dcl1，Ago1，Cpl，Tor，Fab1b，Trn1，Ago4，Fab1c，Fab1d，Arf9，Smg7，Rs41，Ermo2，Spk1，Cul2，Pab2，Sizi，Xrn4，Ein3，Dcl2，Dcl4，Glu1，Trx2。

表1 GO功能(BP)分类中差异基因显著富集通路Top9Table 1 Significant enrichment pathway of differential genes in GO function (BP) classification Top9

2.2 差异表达基因的PPI网络分析结果

图1是包含差异表达基因以及相互作用关系的PPI网络中最主要的子网络(subnetwork)，并将subnetwork1的蛋白互作网络图导出为功能模块图(图2)，由图1、图2看出Fab1家族的Fab1b、Fab1c、Fab1d蛋白基因，Dcl家族的Dcl1、Dcl2、Dcl4蛋白基因，Glu1等基因是重要功能蛋白基因。

红色节点代表上调蛋白，绿色节点代表下调蛋白；颜色间差异代表基因表达水平差异程度，其中颜色越深代表基因表达水平差异越大；面积的大小代表互作程度的高低，其中面积越大表示互作程度越高。图1 PPI网络中的subnetwork1Fig.1 Subnetwork1 in PPI network

2.3 PPI网络中的关键基因

表2是Subnetwork中蛋白互作程度最高的5个Hub node，均来自于Subnerwork1且互作程度大于等于15的节点(Degree≥15)，这表明Acc1、Glt1、Shd、Glu1、Nrpe1这5个基因编码蛋白与其他蛋白存在着较强相互作用，可能是与抗感染有关的关键蛋白。

表2 Subnetwork中蛋白互作程度最高的5个Hub nodeTable 2 The 5 Hub nodes with the highest degree of protein interaction in the subnetwork

2.4 筛选烟草抗南方根结线虫生物过程的重要通路及相关的关键基因

结合PPI网络分析，筛选出Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7个基因与其他基因存在较高程度相互作用，并且也显著富集在相关通路中，显示为关键基因。其中基因Dcl1参与到100多个通路中，基因Dcl2、Dcl4参与到50个以上通路中，基因Fab1c、Glu1、Fab1b、Fab1d参与到10个以上通路中。在PPI网络分析中，这些基因互作程度均大于5，且均在Subnetwork1中，所以这些基因极有可能是与烟草抗南方根结线虫相关的关键基因。

3 结论与讨论

3.1 讨论

南方根结线虫感染烟草是一个复杂的生物学过程，烟草根部被南方根结线虫感染后，基因表达量及相应通路会发生变化，因此，研究引起抗病烟草与感病烟草功能差异的通路至关重要。细胞代谢是生物体一切生命活动的基础[12]，当植物受到环境胁迫时，特别是在植物的抗病防御反应中，会发生次级代谢，产生次级代谢产物。这些产物在植物的机体防御、信号传导和生长发育起着重要作用[13]。在本研究中，发现抗感染烟草品种根部上调基因显著富集在细胞代谢过程调节(regulation of cellular metabolic process)通路中，其中参与光反应和氮同化[14]的基因Glu1(glutamate synthase 1)显著上调，同时参与PPI网络(subnetwork1，图1)。基因Glu1被认为参与光反应为次生代谢提供能量促进次级代谢合成异戊二烯类化合物(如萜类)、酚类化合物和含氮化合物(如生物碱)[15]，在植物防御系统中发挥重要作用[16]。在抗南方根结线虫烟草品种中，基因Glu1上调表达，细胞代谢功能加强，从而推测此烟草品种可以通过增强次级代谢作用产生次级代谢产物，从而间接加强烟草根部防御功能，达到抗南方根结线虫的目的。

核内体在细胞内物质运输过程中发挥重要作用[17-18]，而细胞的物质运输对维持细胞正常代谢及其他生理功能具有重要意义[19]。研究过程中，发现抗感染烟草品种根部上调基因显著富集在核内体转运(endosomal transport)通路。对于抗感染的烟草品种，核内体功能加强，则说明其物质运输功能增强，从而推测该烟草品种可通过增强物质运输能力达到抵抗南方根结线虫的目的。同时有研究报道，endosomal ptdlns(3) p 5-linaseFab1基因对核内体的功能具有重要的调控作用[20]。在本研究中，Fab1b、Fab1c和Fab1d这3个Fab1基因家族成员均在抗感染烟草品种根部显著上调，并参与PPI网络(subnetwork1，图1)。因此，预测这些基因通过参与核内体转运而增强烟草的抗感染能力。

在本研究中发现，抗感染烟草品种根部上调基因显著富集在RNA介导的基因沉默(gene silencing by RNA)通路。RNA介导的基因沉默是生物体用来抵御外界核酸侵入的防御系统，可认为是一种有效的免疫系统[21]。据研究报道，南方根结线虫诱导烟草基因沉默是一种转录后基因沉默，又称为RNA干涉(RNA interference，RNAi)现象[22-23]。基因沉默时需要由小干扰RNA (small interferencing RNA，siRNA)来进行介导[24]，与一些复合物结合，降解mRNA[25]，或者结合在mRNA上作为引物[26]，从而阻断外源基因进行表达。此外，Dcl是参与RNA介导的基因沉默和siRNA形成的关键基因[27-32]，本研究数据显示，Dcl基因家族成员Dcl1、Dcl2、Dcl4均在抗感染烟草品种根部显著上调，并参与PPI网络(subnetwork1，图1)。因此，可以推测出抗南方根结线虫烟草品种通过增强RNA介导的基因沉默途径来达到抗南方根结线虫的效果。其中Dcl2基因编码一种类似于dicer的蛋白质，能在被病毒感染的植物中发挥抗病毒的沉默反应，部分拮抗Dcl2产生的miRNAs，当Dcl4缺失或者受抑制时，可以作为Dcl4的替代物产生siRNA[33]。所以Dcl1、Dcl2、Dcl4在烟草抗南方根结线虫反应中是一个共同作用体系。

3.2 结论

综上所述，本研究通过生物信息学技术对前期获得的转录组数据进行分析，解析抗南方根结线虫烟草的抗感染机制。对抗南方根结线虫烟草根部的差异表达基因进行PPI网络分析，构建蛋白互作网络，揭示这些基因的相互作用及其主要涉及的抗感染相关通路。初步鉴定了Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7个基因均为烟草抗感染相关的关键基因，本研究为进一步在细胞和分子水平研究烟草根部南方根结线虫病的病理发生、发展的分子机制提供理论指导。