纤维素降解菌的筛选及其对西兰花废弃茎叶品质的改善

姚晓红，孙宏，沈琦，周航海，赵志伟，吴逸飞，王新，汤江武*

(1.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021；2.华中农业大学，湖北 武汉 430000)

西兰花富含维生素、糖类、蛋白质、矿物质等多种营养物质，因此有“蔬菜皇冠”的美誉。西兰花(Brassicaoleracea)茎叶中粗蛋白含量在20%以上，还含有多糖、维生素、矿物质等营养物质成分，是一种潜在的植物蛋白饲料资源[1]。我国西兰花种植面积预计已超过2.7万hm2，年产量超过100万t[1]。同时，每年至少超过30万t的西兰花废弃茎叶被丢弃在农田中，这些废弃茎叶的纤维含量较高，直接用于动物饲喂则难以被动物消化。另外，废弃茎叶中的含水率超过90%，极易腐烂，造成环境的污染[2]。利用微生物发酵技术，将西兰花废弃茎叶作为非常规饲料进行开发，有效解决西兰花种植地区环境污染的同时，还能缓解我国蛋白饲料资源短缺的现状，为我国饲料工业的可持续发展提供支持和保障[3]。本文从西兰花种植土壤中分离出一株高效纤维素降解菌，对其进行了菌株鉴定，将其用于西兰花废弃茎叶的发酵，并对发酵产物的营养成分进行了分析，为西兰花废弃茎叶制备发酵饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

西兰花废弃茎叶中粗蛋白含量2.62%，含水率85%，由台州天莱生物科技有限公司提供。

1.2 培养基

(1)酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

(2)产纤维素酶菌种筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

(3)发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，磷酸二氢钾1 g，氯化钠5 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

1.3 菌种的分离与筛选

1.3.1 纤维素降解菌的生物富集及初筛

取西兰花废弃茎叶切成0.5～1 cm左右的块状，称取10 g块状茎叶加入装有100 mL灭菌YPD液体培养基中，同时采用四分法取西兰花种植地泥土100 g，加入装有500 mL灭菌YPD液体培养基的三角瓶中，于30 ℃、200 r·min-1振荡培养72 h。完成培养后，静置片刻，用无菌吸管吸取上清液并进行梯度稀释，将稀释液涂布于纤维素初筛培养基平板上，28 ℃培养72 h，有透明圈长出的菌落即为能产生纤维素分解酶的菌落，并对其进行多次平板划线纯化。然后将经过纯化后有透明圈的菌株转接到纤维素筛选培养基上，每个菌株3个重复，30 ℃培养3 d。将4 mL 1 mg·mL-1的刚果红溶液均匀覆盖于平板上，染色30 min后弃去刚果红溶液，再用1 mol·L-1NaCl溶液冲洗30 min，利用十字交叉法测量菌落直径d(mm)和透明圈D(mm)，根据H值(H=D/d)筛选比值大的菌株进行酶活力测定[4]。

1.3.2 纤维素降解菌的复筛

活化初筛获得的菌种，将其接种于发酵培养基，30 ℃，180 r·min-1振荡培养24 h。于4 ℃，6 000 r·min-1将发酵液离心10 min，对获得的上清液(即粗酶液)进行酶活力测定。

1.4 纤维素酶活力测定

1.4.1 葡萄糖标准曲线绘制

将配制好的1 g·L-1标准葡萄糖溶液，分别吸取0、200、400、600、800、1 000 μL于10 mL比色管中，用蒸馏水补足至2 mL，用蒸馏水作为对照组。分别加入1.5 mL DNS试剂，煮沸5 min。冷却后，加水稀释至10 mL。于540 nm波长处，以空白对照调零，测定吸光值。以吸光度值为横坐标、标准葡萄糖溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程。

1.4.2 CMC活性测定[5-6]

采用DNS法测定纤维素酶活性。取3支10 mL比色管，加入用醋酸-醋酸钠缓冲液配制的0.5%(m/V)CMC-Na溶液1.5 mL，于40 ℃水浴预热10 min，迅速加入0.5 mL粗酶液，40 ℃反应30 min，立即加入DNS试剂1.5 mL以终止反应。将混合液于沸水浴煮沸5 min后冷却，用蒸馏水定容至10 mL，充分摇匀，在540 nm波长处测定吸光度，计算纤维素酶活性。

1.4.3 滤纸酶活性测定[6-7]

将滤纸剪成1 cm×6 cm的长条，放入10 mL比色管中，加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL醋酸钠缓冲液；将试管置于40 ℃恒温水浴中处理30 min，取出后迅速加入1.5 mL DNS试剂，充分摇匀，煮沸5 min。取出冷却后，定容至10 mL，充分摇匀，于540 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算滤纸酶活性。

1.5 菌种鉴定

1.5.1 形态学观察

将菌株于YPD平板划线活化，37 ℃培养24 h，观察菌落形态特征、大小及颜色，镜检观察革兰氏染色后菌体的大小、形态、芽孢形成情况，参照《伯杰细菌鉴定手册》[8]进行部分生理生化指标检测。

1.5.2 菌种的16S rRNA基因测序及系统发育分析

采用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株的基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增，引物为27F和1492R通用引物。PCR扩增体系为25 μL，包括：上下游引物各0.75 μL、DNA模板1 μL、Taq酶0.25 μL、dNTP 0.5 μL、10×酶缓冲液4 μL，ddH2O 17.75 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 31 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。将PCR扩增产物送至上海派森诺生物科技公司测序，测序结果进行NCBI-BLAST比对，通过Mega 5.0软件构建系统发育树。

1.6 西兰花生物饲料制备方法

西兰花废弃茎叶用碎草机切成1～2 cm小段，与米糠和玉米皮按3∶1∶1比例混合均匀，接种0.5%的菌液，装入发酵用呼吸袋中，每袋装量500 g，做3个重复，于30 ℃培养箱中静置培养14 d，取样于50 ℃烘箱烘干进行指标检测。取搅拌均匀的混合原料放入-20 ℃冰箱保存作对照组。

1.7 指标测定

粗蛋白含量测定方法参照GB/T 6432—2018，粗纤维含量测定方法参照GB/T 6434—2006，粗多糖含量测定方法参照SN/T 4260—2015[9]，粗灰分含量测定方法参照GB/T 6438—2007，乳酸含量测定参照GB/T 12456—2008[10]，小肽含量测定参照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》三氯乙酸法[11]。发酵结束后，取2 g烘干后的发酵样品，用电镜专用胶带固定样品，经高真空离子溅射仪喷镀处理，利用Hitachi Regulus 8100扫描电镜进行样品表面结构观察。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的初筛

将分离样品适当稀释后涂布于纤维素初筛平板，37 ℃培养72 h，选取生长快速且透明圈清晰的菌株测量菌落直径d和透明圈直径D，计算H=D/d值，结果见图1和表1。

表1 纤维素降解菌初筛结果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-degrading bacteria

图1 纤维素降解菌的筛选Fig.1 Screening of cellulose-degrading bacteria

从初筛结果可以看出，菌株XLG2-1的H值最大，其次为Bsk-9，其菌落直径和透明圈直径都较大，说明该菌的生长能力和降解纤维素的能力均较强。根据H值大小，选取H较大的5株菌接种至发酵培养基，进行复筛。

2.2 纤维降解菌的复筛

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制

根据DNS法以葡萄糖添加量(mg·mL-1)为横坐标，以D值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2。使用Excel对数据进行分析，得出标准曲线方程为y=1.354 1x+0.027 9，R2=0.999 5，表明该标准曲线的估算值与实际值的拟合度很高。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Glucose standard curve

2.2.2 发酵液酶活性测定

将初筛获得的菌种活化后，接种于发酵培养基，37 ℃，180 r·min-1振荡培养24 h。将培养液于5 000 r·min-1离心10 min，取上清液适当稀释后测定CMC活性、FPA活性和蛋白酶活性，结果见图3、图4。

图3 产纤维素酶菌株的复筛Fig.3 Secondary screening of cellulase producing strains

从图3可知，菌株Y1-3产FPA活性最高，其次为XLG2-1，菌株XLG2-1产CMC活性最高，其次为Bsk-9。图4结果显示，菌株Bs2产蛋白酶活性最高，其次为XLG2-1。综合上述结果，选取菌株XLG2-1作为实验菌株进行后续研究。

2.3 纤维素降解菌的菌株鉴定

2.3.1 形态学及生理生化鉴定

从图5中1可见，菌株XLG2-1在YPD平板上的菌落呈圆形，米黄色，表面湿润、凸起，边缘整齐。图5中2透射电镜下观察菌体呈短杆状。从表2生理生化结果可知，该菌株能水解淀粉、葡萄糖和蔗糖。根据菌落和菌体形态及生理生化结果，同时参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]，初步鉴定菌株XLG2-1为芽孢杆菌属。

表2 菌株XLG2-1的部分生理生化结果Table 2 Partial physiological and biochemical results of strain XLG2-1

1表示菌株XLG2-1菌落形态，2表示菌株XLG2-1透射电镜下菌体形态。图5 菌株XLG2-1形态Fig.5 Morphology of strain XLG2-1

2.3.2 菌种16S rDNA序列测定

经序列分析，菌株XLG2-1的16S rDNA的序列长度为1 466 bp，将测序结果在NCBI上进行BLAST同源性比对并构建系统发育树(图6)，发现该菌株与短小芽孢杆菌Bacilluspumilus(NR 112637)有较高的同源性。综合上述结果，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus。

图6 菌株XLG2-1系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain XLG2-1

2.4 发酵前后营养成分的变化

由表3结果可知，对照组和发酵组的粗多糖含量差异极显著(P<0.01)，粗蛋白、粗灰分、小肽含量有显著差异(P<0.05)，而粗脂肪和粗纤维含量无显著差异(P>0.05)。发酵后的粗蛋白含量比对照组提高了0.41百分点，小肽和粗多糖含量分别比对照组提高了11.5和10.4百分点。发酵组的粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量分别比对照组降低了0.21、0.25和0.02百分点。

表3 西兰花茎叶发酵前后营养成分的变化Table 3 Changes in nutrient composition of stem and leaf of Brassica oleracea before and after fermentation

2.5 发酵前后扫描电镜对比

将发酵前后的西兰花废弃茎叶进行电镜扫描，从图7结果可知，发酵前西兰花废弃茎叶的结构比较完整、紧密，发酵后样品的结构疏松，表面有大量孔洞(箭头指向)，有利于微生物附着。与对照相比，菌株XLG2-1能利用西兰花废弃茎叶生长繁殖，并破坏其结构。

1和2分别为对照组和发酵组。图7 西兰花茎叶发酵前后扫描电镜图Fig.7 Scanning electron microscopy of broccoli stems and leaves before and after fermentation

3 结论与讨论

3.1 产纤维素酶菌株的筛选

土壤的成分非常复杂，不仅包括氧化的腐殖质、动植物残骸和微生物分解的有机质，还有丰富的土壤微生物[13]。由于西兰花中含有较高含量的纤维素，西兰花种植土壤中可能含有较多的纤维素降解菌，因此，本实验以西兰花种植土壤为样品，采用刚果红平板染色和酶活性测定法筛选获得一株纤维素降解菌，经测序鉴定为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus，该菌株在液体发酵培养基中产CMC活性为12.79 U·mL-1，FPA活性为8.99 U·mL-1。本研究与赵龙妹等[14]和吴洁等[15]的报道相同，表明土壤中含有丰富的功能微生物菌种，其中芽孢杆菌属下的部分菌种具有产纤维素酶特性和纤维素降解能力。本研究显示，菌株XLG2-1具有较高的产CMC能力，赵龙妹等[14]从玉米田筛选的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)XT2，李文兵等[16]从牛粪中筛选的内生芽孢杆菌(Bacillusendophticus)CK41，及王尧悦等[17]筛选获得的枯草芽孢杆菌N3的CMC活性。以上酶活力结果存在差异可能与菌种来源及培养条件等有关。

3.2 西兰花废弃茎叶发酵前后营养成分分析

西兰花茎叶粉中粗蛋白含量高达23.0%，除此之外还含有粗脂肪(4.24%)、粗灰分(12.2%)和粗纤维(7.36%)[18]。由于其较高的粗蛋白含量，可以作为畜禽的蛋白资源。本研究结果发现，发酵后西兰花废弃茎叶中粗纤维含量明显降低了0.25百分点，粗多糖含量有明显提高，比对照组提高了10.4百分点，并且扫描电镜结果显示，西兰花废弃茎叶的结构被破坏，说明菌株XLG2-1能在一定程度上降解纤维，将其转化为单糖或二糖，作为自身生长的碳源。同时，在发酵过程中粗蛋白和小肽含量也有明显提高，这可能与菌株XLG2-1较强的产蛋白酶能力有关，将原料中大分子蛋白降解为小分子肽。同时，菌株自身的生长也会引起蛋白含量的增加。张立静等[19]筛选获得一株具有较好纤维素降解能力的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)T-7，当蔗糖和尿素的添加量分别为2%时，纤维素降解率在第8 d达到40.34%。田久东[20]从田间土壤中分离获得产蛋白酶、纤维素酶和产酸能力强的菌株，将其组成复合菌种，发酵西兰花渣50%、米糠粕20%、麸皮20%、喷浆玉米皮10%组成的饲料，发酵后饲料中酸溶蛋白含量为6.68%，与对照组(未添加发酵剂)相比含量提高150%，粗蛋白和还原糖含量分别为23.5%和3%，相较于对照组分别提高了15%和50%。以上结果表明，将菌株XLG2-1用于西兰花废弃茎叶发酵可达到降解纤维素，改善粗蛋白和小肽含量的目的。本研究的结果对于缓解农业废弃物污染问题以及非常规饲用原料的资源化开发都具有十分重要的意义。