点浆条件对酸浆豆腐品质的影响

许 壮, 丁青芝, 戴意强, 王 喆, 刘振田, 陈小阳, 虞利俊, 夏秀东

(江苏大学食品与生物工程学院1,镇江 212013) (江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地2,南京 210014) (临沂市农业技术推广中心3,临沂 276000) (南京果果食品有限公司4,南京 211299)

酸浆豆腐历史悠久,其具有持水性好、口感细腻、味道甘甜等特点[1]。酸浆来源于豆腐制作过程的黄浆水经发酵制得[2,3],与盐卤、石膏和GDL等凝固剂相比,更为绿色安全,且黄浆水作为酸浆生产的原料可以减轻其排放造成的环境污染和处理造成的成本压力[4]。

酸浆豆腐和普通豆腐的生产工艺制作流程主要包括大豆的筛选清洗、浸泡、打浆、过滤、煮浆、点浆、蹲脑、压制、成型,其制作方法尽管有一定的相似性,但酸浆作为凝固剂在豆乳中的添加量远高于传统凝固剂(盐卤、石膏和葡萄糖内酯),使得点浆时豆乳温度、蹲脑温度以及蹲脑时间对豆腐品质产生了与传统凝固剂不同的影响。目前酸浆豆腐生产方式多为手工作坊,酸浆点浆工艺多凭经验,没有规范的点浆工艺,制得的豆腐品质存在较大差异,导致了酸浆豆腐的接受度远不及石膏、盐卤等豆腐[5]。为解决以上问题,刘海宇等[6]发现磨浆料水比在1∶8时得到的豆腐较优;杨岚等[7]研究发现豆腐的凝胶强度随着点浆时豆乳温度的升高逐渐升高,但继续增加温度会对豆腐的凝胶强度和含水量产生负面影响;李娟娟[8]研究了豆乳在点浆后蹲脑不同时间条件下蛋白质结构变化,发现随着时间延长蛋白质的黏弹性逐渐增加。豆乳中主要的蛋白质类型为大豆7S和11S球蛋白,对豆腐的凝胶结构及得率有较大影响[9],有研究表明酸浆点浆时,最开始发生聚集的是11S球蛋白,然后是7S蛋白。因此在酸浆点浆后,蹲脑时间和蹲脑温度可能会影响豆乳中不同蛋白的聚集,从而对豆腐品质产生影响[10,11]。所以对于点浆时豆乳温度、蹲脑温度和蹲脑时间对豆腐品质及豆乳凝固过程的研究极为重要。

目前相关报道主要集中在酸浆的pH、添加量、豆水比、煮浆温度等制作工艺的简单优化[12-14],而对点浆时豆乳温度、蹲脑温度以及蹲脑时间在的豆腐品质中的作用研究较少。因此,本研究通过SDS-PAGE、低场核磁等技术探究点浆温度、蹲脑时间、蹲脑温度对酸浆豆腐品质的影响,并揭示了点浆温度、蹲脑温度、蹲脑时间对豆乳凝固过程的影响,旨在为酸浆豆腐生产过程中的关键因素提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆来自本地市售;新鲜黄浆水由实验室自制;植物乳杆菌ND1031由江苏省农业科学院食品与生物工程创新团队提供;甲醇和乙腈(ACN)均为色谱级;考马斯亮蓝G250、十二烷基硫酸钠(SDS)、硫酸铵、冰乙酸、β-巯基乙醇、三氟乙酸(TFA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、溴酚蓝和其他化学试剂均为分析级。

MJ-100A磨浆机,FiveEasy Plus pH计,Sigma 3K15离心机,HH-4 恒温水浴锅,LRH-150F生化培养箱,Bio-Rad/1658001电泳仪,Tanon3500 凝胶图像分析系统,TMS-Touch质构仪,E-poch酶标仪,NMI20低场核磁共振分析仪。

1.2 实验方法

1.2.1 酸浆制备

新鲜黄浆水经5 000 g离心10 min以去除不溶物后,于108 ℃灭菌20 min,待冷却后接入质量分数3%的已活化植物乳杆菌ND1031,在37 ℃发酵24 h,得到pH为4.0的酸浆。

1.2.2 豆乳及酸浆豆腐制备

200 g大豆清洗3次后在室温下浸泡12 h,大豆沥干水分后与水1∶6(质量比)磨浆,并用200目滤布去除豆渣,得到生豆乳。生豆乳加热煮沸5 min,并于75 ℃保温。向不同温度(35、45、55、65、75、85、95 ℃)的熟豆乳中加入体积分数20%、pH为4.0的酸浆,在75 ℃下水浴30 min;或向75 ℃下熟豆乳加入20%、pH为4.0的酸浆,在不同温度下(35、45、55、65、75、85、95 ℃)水浴30 min;或向75 ℃下熟豆乳中加体积分数20%、pH为4.0的酸浆,在75 ℃下水浴不同时间(0、10、15、20、25、30、40 min)后的豆乳于10 000 g离心20 min,得到豆乳上清液(SSF)和豆乳沉淀(SPF)。豆乳沉淀部分用等体积蛋白溶解液(含2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素和4%CHAPS)溶解后进行蛋白质组学分析。将蹲脑结束的豆乳压制(2.0 kg/cm2)制得酸浆豆腐,并研究点浆温度、蹲脑温度和蹲脑时间对酸浆豆腐的得率、含水量、保水性、质构和感官评价的影响。

1.2.3 豆腐含水量测定

酸浆豆腐含水量测定参照戴意强等[15]的方法。称取2 g(精确至0.000 1 g)豆腐(W1),置于105 ℃烘箱中直至恒重的豆腐(W2)。豆腐的水质量分数(MC)用式(1)表示:

1.2.4 豆腐得率测定

豆腐的得率按照Kang等[16]的方法,用每100 g大豆所获得的豆腐的湿重表示(g/100 g大豆)。

1.2.5 豆腐保水性测定

保水性(WHC)参照Puppo等[17]的方法进行测定。用底部有脱脂棉的50 mL离心管称取质量为m1,称取1.000 0 g(精确到0.000 1 g)豆腐,放于底部有脱脂棉的50 mL离心管中,称此时质量m2,以4 000 g离心10 min后称质量m3,按式(2)计算保水性。

1.2.6 豆腐质构测定

豆腐质构测定参照Ambati等[18]的方法,将豆腐切成5 cm×5 cm×5 cm的立方体,利用TPA进行分析,使用TP250探头将样品压缩2次至50%,测试速度为2 mm/s,2次挤压间隔时间30 s;每种豆腐取3个立方体的样品测定豆腐样品的硬度和弹性,记录测定结果并分析。

1.2.7 感官评价测定

参照Zhang等[19]方法进行感官评定。由20位感官评定员组成,以色泽、气味、质地、口感和可接受程度为感官评定的指标,每个指标实行1～9评分制,如表1所示。

表1 酸浆豆腐感官评价表

1.2.8 蛋白含量测定

豆乳中SSF和SPF蛋白质含量的测定参照Stanojevic等[9]的方法,取1.2.2中样品100 μL或BSA加入已稀释4倍的考马斯亮蓝G250溶液,混合均匀后暗反应10 min,用分光光度计测定样品在595 nm下的吸收光,并根据BSA标准曲线计算得到样品中蛋白含量,单位用mg/mL表示。

1.2.9 SDS-PAGE分析

按照Wu等[20]方法对SSF和SPF进行SDS-PAGE分析。准备以下缓冲液:上样缓冲液,含质量浓度为2 mg/100 mL SDS,体积分数为5%的β-巯基乙醇,体积分数为10%的甘油,0.02 mg/100 mL溴酚蓝;70 mmol/L Tris-HCl缓冲液。向0.9 mL上样缓冲液中加入0.1 mL样品液,混合均匀后于95 ℃水浴5 min,冷却后10 000 g离心10min。样品的上样量为10 μL,浓缩胶和分离胶的质量分数分别为5%和10%,样品进胶前电压为60 V,当溴酚蓝指示剂达到分离胶时,电压增加至90 V。SDS-PAGE电泳完成后,小心取下蛋白胶,并放入考马斯亮蓝G250溶液中染色,待染色结束后,将蛋白胶放在脱色液中直至蛋白蓝色条带显现且背景清晰。使用Quantity One软件和Gel-Pro软件对条带进行分析。结果表示为SSF或SPF中每个蛋白质亚基含量占豆乳中对应亚基含量的百分比。

1.2.10 低场核磁共振

参照Tang等[21]的方法,核磁共振Carr-Purcel-Meiboom-Gill (CPMG)序列弛豫测量在台式脉冲NMR分析仪PQ001上进行。质子共振频率22.6 MHz,测量温度32 ℃。约2 g样品放入直径为15 mm的核磁管中,而后放入分析仪中检测。横向弛豫时间T2测量所使用参数τ值(90o～180o脉冲间隔)为50 μs;重复扫描16次;相邻重复测量的间隔时间3 s;回波个数为3 000。每个样品有10个重复。

1.3 实验数据分析

实验数据重复测定3次,结果用“平均值±标准差”表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较不同处理之间的显著性差异(P<0.05)。分别用SPSS 22.0软件和Origin 8.5软件对数据进行统计分析和绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同点浆温度对豆腐品质及豆乳中蛋白凝固的影响

2.1.1 不同点浆温度对豆腐品质的影响

选择蹲脑温度为75 ℃、蹲脑时间为30 min,分析点浆时不同豆乳温度对酸浆豆腐品质的影响,结果如表2和图1所示。随着点浆时豆乳温度的升高,豆腐硬度明显降低,而豆腐的得率、含水量和保水性则呈先升高后降低的趋势,在豆乳温度为75 ℃时,酸浆豆腐的硬度最小为16.94 N,而弹性、得率、水质量分数和保水性最大分别为4.97 mm、229.50%、75.56%和65.72%。这可能是点浆温度较低时,蛋白发生自聚集,在压制过程中保留水的能力较差,与戴意强等[15]研究发现的含水量越高,豆腐的硬度越低的结果一致。如图1b感官评分结果所示,在点浆温度为75 ℃时,此时制得的豆腐口感佳,风味优,表观、色泽和可接受度较好。因此,当点浆时豆乳温度为75 ℃时,酸浆豆腐品质最优。

表2 点浆时不同豆乳温度酸浆豆腐质构

注:不同小写字母表示同一品质指标下不同点浆温度之间结果存在显著性差异(P<0.05)。图1 点浆时不同豆乳温度酸浆豆腐的品质分析

2.1.2 点浆时不同豆乳温度对豆腐水分分布的影响

点浆时不同豆乳温度的酸浆豆腐中水分分布的弛豫曲线如图2所示,随着弛豫时间增加,所呈现3个峰为T2b、T21、T22,T21和T22被认为是和大分子紧密结合的水,而T21组分超过总信号量的90%,T2b和T22对保水性和物理特性影响很小[22],所以本研究着重研究T21组分。弛豫时间指的是各组分曲线最高点所对应的时间,李腾[23]研究表明T21弛豫时间与豆腐保水性呈极强的正相关,当点浆时豆乳温度为75 ℃时,豆腐水分分布的T21弛豫时间最大为32.75 ms,这与豆腐含水量与保水性研究结果一致。这可能是因为点浆时不同的豆乳温度会对豆腐的凝胶强度和保水性造成一定影响[24],从而影响豆腐的水分分布。

图2 点浆时不同豆乳温度酸浆豆腐水分分布的弛豫曲线

2.1.3 不同点浆温度对豆乳中蛋白凝固的影响

新鲜煮沸的豆乳在10 000 g离心作用下几乎没有蛋白质沉淀。然而当向煮沸的豆乳中添加凝固剂时,大豆蛋白发生相互聚集,形成凝聚体[25]。如图3所示,随着点浆时豆乳温度的增加,离心后SPF蛋白质质量浓度维持在8.35 mg/mL,SSF蛋白质质量浓度约1.10 mg/mL,这可能是因为点浆结束后,继续对豆乳进行了一段时间的水浴,未反应完全的蛋白质继续反应,导致对蛋白含量几乎无影响,但是由于温度的变化,可能对蛋白凝胶强度和持水性等豆腐品质有较大影响[26]。

在豆乳中,7S和11S球蛋白是2种主要的蛋白质类型[27]。点浆时不同豆乳温度对豆乳SSF和SPF含量中7S和11S大豆蛋白各亚基的分布及变化如图4所示。随着点浆时豆乳温度的增加,SPF中的亚单位蛋白带的强度和含量无明显变化,以及SSF中亚单位蛋白带和含量也呈现相同变化,与蛋白含量变化结果一致。

图3 点浆时不同豆乳温度对豆乳SPF及SSF蛋白含量

图4 点浆时不同豆乳温度诱导豆乳蛋白凝固的SSF和SPF蛋白电泳

2.2 不同蹲脑温度对豆腐品质及豆乳中蛋白凝固的影响

2.2.1 不同蹲脑温度对豆腐品质的影响

选择点浆时豆乳温度为75 ℃和蹲脑时间为30 min,分析不同蹲脑温度对酸浆豆腐品质的影响,如表3和图5所示。随着蹲脑温度的升高,酸浆豆腐的硬度先降低后升高,而豆腐得率、含水量和保水性先升高后降低,在蹲脑温度为75 ℃时,豆腐硬度最小,为13.52 N,而弹性、得率、水质量分数和保水性最高,分别为5.76 mm、235.1%、75.81%、65.89%。这可能是因为豆乳体系蛋白结构复杂,当点浆结束后还存在少量的蛋白未形成凝聚体,还需要提供适宜的反应条件,但如果维持反应的温度过高,会对凝胶强度和持水性出现负面影响[7,28]。结合图5b感官评分结果,当蹲脑温度为75 ℃时,酸浆豆腐口感佳,风味优,表观、色泽和可接受度都最好,此时酸浆豆腐品质最优。

注:不同小写字母表示同一品质指标下不同蹲脑温度之间结果存在显著性差异(P<0.05)。图5 不同蹲脑温度酸浆豆腐的品质分析

表3 不同蹲脑温度酸浆豆腐质构

2.2.2 不同蹲脑温度对豆腐水分分布的影响

不同蹲脑温度下豆腐水分分布的的弛豫曲线如图6所示。结果表明,当蹲脑温度为75 ℃时,豆腐中水分分布的T21弛豫时间最大分别为32.75 ms,这与豆腐的保水性研究结果一致。这可能是因为蹲脑温度会对点浆后蛋白反应及结构造成影响,从而影响对酸浆豆腐的凝结网络结构,从而造成豆腐的水分分布的差异[11,29]。

2.2.3 不同蹲脑温度对豆乳中蛋白凝固的影响

如图7所示,随着蹲脑温度的升高,豆乳中的蛋白颗粒形成的凝聚体越来越多,离心后豆乳SPF中蛋白质含量逐渐增加,而SSF中蛋白质含量随着温度升高而逐渐下降,并在75 ℃时达到平衡,说明75 ℃是蹲脑温度的关键温度。

图7 不同蹲脑温度SPF及SSF蛋白含量

如图8所示,不同蹲脑温度对SSF和SPF中蛋白质的SDS-PAGE电泳图结果表明,随着蹲脑温度的升高,SPF中的蛋白亚基浓度随着蹲脑温度的升高而增加,而SSF中蛋白质亚基条带强度与蹲脑温度呈负相关。随着蹲脑温度的升高,SPF的各蛋白亚基含量逐渐增加,而SSF的各蛋白亚基含量逐渐减少,并在75 ℃时达到平衡,与上述蛋白含量变化一致。这可能是因为大豆蛋白的主要组成是7S和11S球蛋白,其中7S组分包括α、α’及β3个亚基,11S组分包括6个酸性A亚基和6个碱性B亚基,蛋白结构复杂[27],需要提供适宜的温度条件以供继续反应。因此,75 ℃的蹲脑温度是豆乳凝固的关键点。

图8 SSF和SPF蛋白电泳图以及各蛋白亚基相对含量

2.3 不同蹲脑时间对豆腐品质及豆乳中蛋白凝固的影响

2.3.1 不同蹲脑时间对豆腐品质的影响

选择点浆时豆乳温度为75 ℃、蹲脑温度为75 ℃,分析不同蹲脑时间对豆腐品质的影响,如表4和图9所示。随着蹲脑时间的延长,酸浆豆腐的硬度先降低后升高而弹性、得率、含水量和保水性都想先增加后减少,并在当蹲脑时间为20 min时达到最值,此时制得的豆腐硬度最小为15.80 N,而弹性得率、水质量分数、保水性都最高,分别为5.15 mm、241.3%、76.36%、65.68%。结合图9b感官评分结果,蹲脑时间为20 min时,豆腐口感佳,风味优,表观、色泽和可接受度都最好。有研究表明,酸浆豆腐中主要以β结构为主,点浆后0 min时,蛋白质结构由无规则状态转向β转角、β折叠和α螺旋,且α螺旋的占比较少。点浆后10 min,α螺旋减少,β折叠增多,在点浆后20～30 min内,体系趋于稳定,主要体现在得率与豆腐质构上,此时豆腐的品质最好[8,11],本研究结果也表明蹲脑时间在20～30 min时,豆腐品质最佳。

注:不同小写字母表示同一品质指标下不同蹲脑时间之间结果存在显著性差异(P<0.05)。图9 不同蹲脑时间的酸浆豆腐分析

表4 不同蹲脑时间对酸浆豆腐质构影响

2.3.2 不同蹲脑时间对豆腐水分分布的影响

不同蹲脑时间下豆腐水分分布的弛豫曲线如图10所示。结果表明,蹲脑时间对T21的弛豫时间影响较大即对豆腐的保水性影响较大。当蹲脑时间为20 min时,豆腐水分分布的T21组分和弛豫时间均高于其他蹲脑时间制得的豆腐为43.29 ms。可能是因为点浆结束后蛋白之间还需要继续反应[8],而反应时间过长,蛋白凝聚体长时间暴露可能会导致巯基氧化现象严重,对豆腐凝胶造成负面影响[28],从而对豆腐的水分分布造成差异。

图10 不同蹲脑时间豆腐水分分布的弛豫曲线

2.3.3 不同蹲脑时间对豆乳中蛋白凝固的影响

图11为固定点浆时豆乳温度为75 ℃、蹲脑温度为75 ℃时,不同蹲脑时间对豆乳蛋白凝固过程的影响。随着蹲脑时间的延长,豆乳中的蛋白颗粒形成的凝聚体越来越多。离心后SPF中蛋白质含量逐渐增加,而SSF中蛋白质含量逐渐下降,在20 min时达到平衡,说明蹲脑时间20 min时是豆乳凝固关键点。

图12为不同蹲脑时间对SSF和SPF含量中7S和11S大豆蛋白各亚基的分布及变化。如图12所示,SPF中的蛋白亚基浓度随着蹲脑时间的延长而增加,而SSF中蛋白亚基与之呈相反规律。图12c和图12d为不同蹲脑时间诱导豆乳蛋白凝固的SSF和SPF各蛋白亚基占总蛋白含量变化,结果表明,SPF中7S蛋白含量明显低于11S蛋白含量,随着蹲脑时间的延长,沉淀中各蛋白亚基含量随之增加,但7S蛋白的增速要显著大于11S蛋白,并在20 min时达到平衡。这可能是因为点浆结束后,参与反应的主要是7S蛋白,它的含量较少,反应较慢[30],所以沉淀蛋白含量呈现上升后趋于稳定的趋势,与豆腐品质研究结果一致。

图12 不同蹲脑时间诱导豆乳蛋白凝固的SSF和SPF蛋白电泳以及各蛋白亚基占总蛋白含量的百分比

3 结论

本研究以豆腐品质(感官评分、含水量、保水性、得率、弹性、硬度等)为指标,通过分析点浆时豆乳温度、蹲脑温度以及蹲脑时间对豆乳中大豆蛋白凝固过程、蛋白亚基条带和豆腐中水分分布的变化,不仅优化酸浆豆腐制作工艺参数,还阐明了这3个因素导致豆腐品质差异的机理。