饲料酵母水溶物具有促进草鱼原代肝细胞生长及修复过氧化氢损伤的作用

马 杰, 王卓君, 石瑶瑶, 叶元土, 蔡春芳, 吴 萍, 陈 鹏

(苏州大学基础医学与生物科学学院1,苏州 215123) (江苏省水产动物营养重点实验室2,苏州 215123) (北京英惠尔生物技术有限公司3,北京 100081)

在水产养殖过程中,多种因素如水环境条件、饲料中有害物质等均可引起养殖鱼类发生严重的氧化应激,并导致鱼体健康损伤、病害的发生和发展,给养殖业带来不可忽视的损失。氧化应激是指体内的氧化和抗氧化的失衡,会导致细胞损伤、甚至死亡。氧化损伤是细胞损伤的主要类型之一,如何通过饲料途径修复鱼体氧化损伤的细胞、维护鱼体主要器官组织的结构及功能完整性是现代营养与饲料研究的重要领域之一。酵母类饲料在水产饲料中被广泛用于增强鱼体免疫防御功能和抗氧化损伤的功能,已经成为一类常规的饲料添加剂[1]。在建立草鱼原代肝细胞H2O2损伤模型、并研究饲料酵母对氧化损伤修复的基础上[2],本实验选择3种酵母饲料产品制备成水溶物冻干粉,并用于对草鱼原代肝细胞生长的影响和对H2O2损伤细胞的修复实验。旨在通过离体细胞实验,探究饲料酵母水溶物对草鱼原代肝细胞生长影响、对氧化损伤细胞的修复效果和作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验鱼

用于原代肝细胞分离的材料鱼为平均体重(27.92±5.47)g的一冬龄草鱼幼鱼,饲养于苏州大学鱼类循环养殖系统中,每天使用实验室自制的草鱼饲料(粗蛋白质质量分数28%、粗脂肪质量分数6%)饱食投喂1次,每2 d更换1/2体积的水。定期监测水环境变化,维持水体中溶氧量为4.5～4.8 mg/L、pH为7.5～8.0、水温20～28 ℃。

1.2 饲料酵母水溶物的制备

取3种饲料酵母产品(菌种均为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae),其营养组成见表1。样品粉碎后全部过60目标准筛,定量称取实验样品、加入双蒸水、搅拌均匀,置于4 ℃浸泡24 h。使用孔径为3 μm的低速滤膜抽滤,将得到的滤液冷冻干燥,所得冻干粉置于-80 ℃低温冰箱保存备用。

分别称取一定量的酵母水溶物冻干粉,完全溶解于无菌PBS溶液中,使样品水溶物的质量浓度为25 mg/mL,使用0.22 μm微孔滤膜过滤后,4 ℃保存,现配现用。

表1 3种饲料酵母产品成分质量分数/%

1.3 草鱼原代肝细胞分离与培养

参照秦洁等[3]的原代肝细胞分离方法,原代肝细胞置于体积分数5% CO2、27 ℃的细胞培养箱中培养,24 h后更换一半的培养液。

1.4 水溶物浓度对原代肝细胞生长影响实验

3种酵母水溶物分别设置6个质量浓度梯度,用完全培养基(在M199培养液中加入15 mg/100 mL胎牛血清、1 mg/100 mL三抗和1 mg/100 mL牛胰岛素)按梯度稀释,分别使3种饲料酵母水溶物的质量浓度为0(对照组)、25、50、100、200、400 mg/L。原代肝细胞培养16 h(细胞融合率约为50%)后更换培养液,继续培养24 h。随后,使用MTT法测定3种水溶物对原代肝细胞生长的影响,并依据对照组计算各组细胞相对活力。

1.5 H2O2损伤模型及水溶物对损伤模型修复作用的实验设计

参照石瑶瑶等[2]的方法建立草鱼原代肝细胞的H2O2损伤模型(H2O2组),以不添加H2O2和水溶物的实验组为对照组。按照H2O2模型组实验条件,细胞培养1 h后,分别用含有3种水溶物(为1.4筛选的最佳促生长浓度)的完全培养基更换培养液,分别为YC-A、YC-B和YCP实验组,见表2。

表2 酵母水溶物对草鱼原代肝细胞H2O2损伤的修复作用实验设计

1.6 实验方法

1.6.1 细胞活力检测

使用MTT法检测并计算相对细胞活力,计算公式为:

1.6.2 培养液中LDH活性检测

收集各处理组细胞的培养液,根据LDH试剂盒方法检测并计算培养液中LDH活性。

1.6.3 透射电镜观察细胞超微结构变化

分别收集各组细胞,加入体积分数为2.5%戊二醛溶液,避光固定。用预冷PBS漂洗,1%锇酸溶液后固定30 min后,使用梯度浓度的丙酮(体积分数分别为50%、70%、90%、100%)在室温下脱水、包埋剂(V100%丙酮∶V树脂=1∶1)浸透2 h、包埋固化、修块、超薄切片、柠檬酸铅和醋酸铀染色,在透射电镜下(TEM)观察超微结构变化。

1.6.4 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡

建立原代肝细胞氧化应激模型后,在培养液中分别加入3种饲料酵母水溶物继续培养24 h,收集所有细胞,每组3个重复,每个样本细胞量在10 000个左右。加入5 μL Annexin V-FITC、10 Μl PI (碘化丙啶)染色液。避光孵育15 min后置于冰浴,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6.5 线粒体膜电位(MMP)检测

线粒体膜电位检测使用JC-1试剂盒,在收集好的细胞中加入500 μL JC-1工作液,重悬细胞,置于37 ℃培养箱中避光孵育30 min。孵育完成后收集细胞,使用缓冲液清洗3次,重悬细胞,使用流式细胞仪检测。

1.6.6 细胞内活性氧(ROS)检测

细胞内ROS水平通过DCFH-DA氧化引起的荧光变化来检测。细胞经处理后,将DCFH-DA加入培养基中,置于27 ℃培养箱中孵育30 min,收集细胞,PBS洗涤2次,随后使用流式细胞仪检测。

1.6.7 转录组学分析

收集各组细胞,每组3个重复,加入适量Trizol裂解细胞。将充分裂解的细胞转移至冻存管,在液氮中速冻,用于后续测序。RNA提取与RNA-seq测序技术服务由北京百迈客生物科技有限公司提供,采用Illumina高通量测序平台对cDNA文库进行测序,生成高质量的原始数据(Raw Data)。对Raw Data进行过滤,去除N的比例大于10%的Reads、质量值Q≤10的碱基数占整条Read的50%以上的Reads,获得高质量的Clean Data。利用生物学信息手段对转录组测序数据进行分析,将Clean Data与指定的参考基因组序列对比(参考基因组下载地址见:http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/),进行文库质量评估、序列结构分析、差异基因分析。使用DEseq2软件进行差异表达分析,筛选条件为基因差异表达量的对数值Fold Change≥1.5且P<0.01。

1.7 数据分析

所有结果均以至少3次独立实验的平均值±标准差表示。使用SPSS 22.0软件对实验数据进行单因素方差分析,并使用Duncan氏多重比较分析检验组间差异显著性,P<0.05为差异显著,P<0.01表示差异极显著。使用GraphPad Prism 9进行统计分析及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 细胞生长观察

如图1所示,刚分离的草鱼原代肝细胞呈规则的球形或椭球形,离散分布于细胞板上。培养16 h后,观察到细胞贴壁生长且其融合率(细胞融合汇片的面积与细胞板的孔底面积的百分比)在50%左右;培养24 h细胞融合率能够达到80%,生长状态良好。

图1 显微镜下肝细胞的形态

2.2 水溶物浓度对原代肝细胞生长的影响

图2为各组草鱼原代肝细胞活力的测定结果,细胞活力随着3种水溶物的质量浓度增加而增加。与对照组0 mg/L比较,YC-A质量浓度为25 mg/L时无显著差异(P>0.05),质量浓度在50～400 mg/L时,细胞活力极显著增加(P<0.01);YC-B质量浓度为25 mg/L和400 mg/L时差异显著(P<0.05),50～200 mg/L差异极显著(P<0.01);YCP质量浓度为25、400 mg/L时无显著差异(P>0.05),质量浓度在50～200 mg/L时差异极显著(P<0.01)。

结果表明,3种水溶物对原代肝细胞表现出良好的促生长作用,并表现出促进细胞生长的二次方程曲线剂量效应。为便于进一步研究水溶物对氧化应激状态下细胞的保护作用,分别在3种水溶物的促生长质量浓度范围内选取1个最佳促生长质量浓度进行后续试验,即YC-A、YCP为100 mg/L,YC-B为200 mg/L,细胞活力分别为(119.48±6.93)%、(124.98±8.48)%、(117.52±6.73)%。

图2 不同质量浓度水溶物对细胞活力的影响

2.3 对H2O2诱导的草鱼原代肝细胞氧化应激的修复效果

2.3.1 细胞活力变化

利用H2O2诱导的草鱼原代肝细胞氧化损伤模型,比较3种水溶物对原代肝细胞生长的影响结果,见图3。H2O2组与对照组比较,细胞活力极显著下降(P<0.001);与H2O2组相比,YC-A组、YC-B组和YCP组细胞活力极显著提高(P<0.001),表明3种饲料酵母水溶物具有修复肝细胞H2O2氧化损伤的作用,使受到损伤的肝细胞活力得到显著的恢复。

图3 水溶物对损伤细胞的活力影响

2.3.2 培养液中LDH活性

培养液中LDH活性可以显示培养细胞膜的通透性。各组细胞培养液中LDH活性测定结果见图4。H2O2组与对照组相比,培养液中LDH活性极显著提高(P<0.001),表明H2O2对肝细胞膜造成损伤导致细胞膜通透性显著增加。3种水溶物处理组与H2O2组相比,培养液中LDH活性极显著降低(P<0.001),显示3种水溶物可以修复受损肝细胞的细胞膜通透性。

图4 培养液中LDH活性

2.3.3 肝细胞超微结构

如图5所示,对照组细胞形状呈椭圆形,细胞膜完整,胞质分布均匀,细胞核核仁清晰且核膜完整,染色质分布均匀,线粒体丰富、且嵴清晰。H2O2组的细胞显示出了典型的线粒体损伤,线粒体肿胀、嵴扭曲或消失,细胞核固缩、染色质凝集,细胞核位置偏移,细胞内出现空泡。3种水溶物处理组对H2O2诱导的细胞损伤表现出了明显的修复效果,主要体现在线粒体肿胀情况得以改善,但与对照组相比细胞仍有损伤的形态学特征,如染色质凝集、胞内空泡、部分线粒体轻微肿胀及嵴模糊等。

图5 肝细胞超微结构变化

2.3.4 细胞凋亡特征指标

由细胞的凋亡图(图6a)及凋亡率(图6b)可知,H2O2组与对照组相比,凋亡率从(20.00±3.88)%上升到(71.37±2.44)%,差异极显著(P<0.001);与H2O2组比,3种水溶物处理组凋亡率极显著降低(P<0.01),YC-A组、YC-B组和YCP组的凋亡率分别为(58.87±4.37)%、(58.63±3.73)%、(46.88±4.35)%。与对照组相比,H2O2处理极显著增加了细胞内ROS含量(P<0.001),细胞内ROS水平达到正常细胞的3倍以上。与H2O2组比较,3个水溶物处理组极显著抑制H2O2诱导的细胞内ROS的产生量(P<0.01)。H2O2组与对照组相比,MMP极显著降低(P<0.001);3个水溶物处理MMP均极显著高于H2O2组 (P<0.001)。

图6 饲料酵母缓解H2O2诱导的细胞凋亡

2.4 差异表达基因(DEGs)分析

依据转录组结果,使用DESeq2进行分析,设置参数错误发现率(FDR)≤0.01且差异倍数(FC)≥1.5筛选差异表达基因。结果如表3所示,对照组与H2O2组比较,差异表达的基因共计505个,其中,283个基因表达上调、222个基因表达下调;YC-A组与H2O2组相比,差异表达的基因共计34个,其中,29个基因表达上调、5个基因表达下调;YC-B组与H2O2组相比,差异表达的基因共计1 400个,其中,754个基因表达上调、646个基因表达下调;YCP组与H2O2组相比,差异表达的基因共计186个,其中,139个基因表达上调、47个基因表达下调。

表3 差异表达基因数目统计表

从差异表达基因集H2O2/对照组、H2O2/YC-A、H2O2/YC-B、H2O2/YCP中筛选出与氧化损伤相关的关键基因,见表4。

3 讨论

3.1 饲料酵母水溶物能够促进原代肝细胞生长活性

酵母培养物为以酿酒酵母为菌种,经固体发酵后浓缩、干燥获得的产品,其中包含有酵母菌体、酵母次级代谢产物和残余的培养基。酵母细胞壁为酿酒酵母经液体发酵后得到的菌体,再经酶解后分离、干燥获得的细胞壁产品,其主要成分包括β-葡聚糖和甘露聚糖[1]。本实验中制备的酵母水溶物去除了饲料酵母中的非水溶性物质,包括无活性的酵母菌体、非水溶性蛋白质和不溶性糖等。在本实验的条件下,3种酵母产品的水溶物对草鱼原代肝细胞的生长都表现出一定的促进效果,即除YC-A 25 mg/L组、YCP的25 mg/L和400 mg/L组外,其他各实验组的结果均显著或极显著地高于对照组。这一方面可能由于酵母水溶物能够为细胞提供其生长所需的营养物质,另一方面可能是水溶物中的某些生物活性物质和未知促生长因子发挥了促生长作用。同时,3种水溶物对细胞的促生长效果表现出二次方程的曲线剂量效应,即低质量浓度时效果不明显,如YC-A组和YCP组水溶物质量浓度为25 mg/L时,对细胞促生长作用不显著(P>0.05);在达到最适宜质量浓度下具有最佳促进生长的效果,如YC-A、YCP、YC-B添加量在 100、100、200 mg/L时表现出最佳的促生长效果。然而还难以解释高质量浓度的酵母水溶物反而导致培养细胞生长下降的原因,影响因素可能是多方面的。实际生产中,在配合饲料中添加酵母类产品有适宜的添加量,过低、过高的添加量其没有显示出更好的饲料效果[1,15]。

表4 关键差异表达基因

饲料酵母水溶物含有促进细胞生长的成分,且具有最适宜的添加剂量效应关系,质量浓度过高、过低均不显著。

3.2 饲料酵母水溶物能够缓解原代肝细胞线粒体途径的凋亡与损伤

线粒体作为细胞的主要细胞器,在调节细胞凋亡方面发挥着关键作用。H2O2是一种强氧化剂,能够穿透细胞膜,极易转化为高活性的羟基自由基、过氧自由基等,攻击线粒体呼吸链的生物氧化途径,导致抗氧化酶活性降低、生成大量的ROS,导致细胞氧化应激,进而激活线粒体凋亡途径[13]。

饲料酵母能够通过调控细胞和组织中的多种生理或病理事件,提高水产动物机体抗应激能力[14,15]。本实验发现,饲料酵母水溶物能够缓解H2O2诱导的细胞凋亡,主要表现为显著降低细胞凋亡率、显著降低细胞内ROS水平。相较于模型组,YCP、YC-A和YC-B分别使细胞内ROS水平降低了16.51%、9.37%、21.16%,凋亡率降低34.32%、17.51%、17.85% (图6)。在线粒体凋亡途径中,线粒体外膜的可渗性是凋亡触发的关键,该过程涉及粒体膜通透性转换孔道的打开,从而改变线粒体外膜通透性,在细胞质中高水平的Ca2+影响下,导致MMP的降低[16]。饲料酵母水溶物能够提高氧化应激下的肝细胞的线粒体膜电位,本实验中,H2O2作用下肝细胞MMP下降了54.52%;而在3种水溶物处理后均不同程度提高了MMP(图6),相较于模型组细胞MMP水平,YCP组、YC-A组、YC-B组分别提高了65.18%、11.51%、16.69%。

线粒体是细胞能量代谢中心,线粒体膜电位的异常往往表明线粒体功能障碍,提示着细胞内供能及代谢受阻,从而影响细胞活力。本实验结果表明,饲料酵母水溶物能够提高氧化应激状态下原代肝细胞的细胞活力。此外,饲料酵母水溶物能够维持细胞膜完整性、修复H2O2诱导的原代肝细胞超微结构损伤。乳酸脱氢酶(LDH)位于正常细胞的细胞质中,当细胞受到损伤时,会释放到细胞外,是细胞损伤的敏感标记物[17]。通过检测培养液中LDH活性,发现3种水溶物均能降低培养液中LDH活性,结合透射电镜结果(图5)可知,3种水溶物作用下,氧化损伤的肝细胞超微结构得以修复和改善,细胞膜完整性得以维持。

3种酵母产品水溶物通过对细胞膜完整性修复、线粒体膜损伤的修复、降低细胞内ROS水平等途径,对H2O2诱导的草鱼原代肝细胞损伤进行有效的修复,主要表现为显著降低受损肝细胞凋亡率、有效促进原代肝细胞生长能力。

3.3 饲料酵母水溶物对原代肝细胞的保护机制

为进一步阐明饲料酵母水溶物对细胞的保护机制,通过转录组学分析饲料酵母水溶物处理组与模型组之间的关键DEGs,见表4。其中,基因g6pd是4个差异基因表达集中共同涉及的DEG。H2O2作用下基因g6pd表达受到抑制,而3种水溶物处理后表达上调,提示饲料酵母水溶物能够提高细胞抗氧化能力。H2O2组基因nqo1、spartin表达下调,但YCP水溶物处理后nqo1上调,YC-B处理后spartin表达上调,提示饲料酵母水溶物能够维持线粒体形态和功能正常。线粒体功能异常会阻碍ATP合成,使细胞内能量供给受限,影响细胞活力。TCA循环与磷酸戊糖途径(PP途径)同属于细胞的中心碳代谢通路,对细胞能量供给至关重要。转录组结果显示,在H2O2作用下TCA循环通路(suclg2、cs、idh1)和PP途径中(g6pd、tkt、6pgd)的关键DEGs表达受抑制,在3种饲料酵母水溶物处理后表达上调,提示饲料酵母水溶物可能能够缓解细胞内能量供应障碍,从而提高细胞活力。DIABLO是线粒体内的促凋亡蛋白,能够通过结合凋亡抑制蛋白(IAPs)诱导细胞凋亡[11],本研究中,YC-B组和YCP组基因diablo相比模型组下调。这些结果验证了饲料酵母对H2O2诱导的氧化损伤具有保护作用,提示3种水溶物具有促进原代肝细胞生长增殖、缓解H2O2诱导的线粒体途径凋亡的作用。

与其他脊椎动物一样,鱼类肝脏富含Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶用于清除外源药物或毒物。细胞色素P450(CYP450)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)分别是肝脏的Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶,在外源性物质的代谢中起着关键作用[9,10]。YCP可能通过提高肝细胞内解毒酶基因表达水平,即提高细胞药物代谢能力,从而保护细胞免受氧化损伤。YCP组与H2O2组相比,CYP450相关基因(cyp3a27、cyp2g1、cyp3c1、cyp27a1)表达上调;谷胱甘肽代谢通路中基因(gsta、gst3、gsto1)上调。

YC可能通过调节细胞内GSH水平,抑制细胞铁死亡发生。发生铁死亡时,细胞内的谷胱甘肽(GSH)被消耗,导致谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)失活,最终导致脂质过氧化和大量活性氧的产生[18]。胱氨酸/谷氨酸逆转运体(system-Xc)和GPX4是铁死亡的关键调节因子[19]。本研究中细胞经YC-B处理后,slc7a11表达上调。SLC7A11是system-Xc的重要组成部分,system-Xc可以通过胱氨酸转运来维持GPX4的活性[20]。slc7a11上调可能使运输到细胞中的胱氨酸量增多,从而提高细胞内GSH水平,促进GPX4对铁死亡的抑制功能。GCLC是谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)的亚基,通过调节GSH的表达,发挥抗氧化作用[8]。YC-A和YC-B处理细胞后,gclc表达上调。此外,YC-A可能通过上调铁蛋白含量,维持细胞内铁稳态。FTH1是铁死亡的负调节因子,FTH1下调使得铁储存减低,铁超载促进铁死亡。本研究中YC-A处理细胞后,基因fth1上调。

4 结论

饲料酵母水溶物不仅能够促进草鱼原代肝细胞生长活性,还可以降低细胞内ROS水平、提高细胞抗氧化能力,从而保护细胞免氧化损伤。转录组结果提示,YCP可能通过增加细胞内Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶保护细胞免受氧化损伤,而YC对细胞的保护可能是通过调控细胞内铁稳态实现的。