河北省圈养貉子隐孢子虫流行现状调查

陈东前, 张玉瑾, 王建秋, 王明星, 祝玉巧, 罗 辉, 王秋悦, 刘欣超, 李文超*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100;3.河北科技师范学院 河北省预防兽医重点实验室,河北 秦皇岛 063000)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)引起的一种呈全球性分布的人兽共患原虫病,主要感染脊椎动物,其症状表现为腹泻、营养不良、生长发育受阻等[1-3]。该虫通过粪-口途径传播,人或动物通过摄入被隐孢子虫卵囊污染的水或食物,或直接接触隐孢子虫病患者或患病动物而引起感染,严重会导致死亡[4-5]。

貉子(NyctereutesprocyonoidesGray)为食肉目(Carnivoraes)、犬科(Canidae)、貉属(Nyctereutes)动物,其作为一种珍贵的毛皮动物,具有很高的经济价值。寄生虫病严重威胁貉子健康的一类疾病,尤其是人工饲养的貉子,其饲养密度较高,活动范围窄,易引起寄生虫病流行。目前,已报道貉子可感染犬隐孢子虫(C.canis)、微小隐孢子虫(C.parvum)和安氏隐孢子虫(C.andersoni)等3种常见人兽共患隐孢子虫虫种,其中C.parvum还是人最常感染的两种隐孢子虫之一[6-12]。

目前中国貉子养殖主要分布在东北三省及山东、河北等省份[13]。迄今,中国山东[6]、河南[7]、新疆维吾尔自治区[14]、东北三省[8,15]等省份已有貉子隐孢子虫感染的相关报道,河北省作为貉子养殖大省之一,目前仅见昌黎地区有貉子隐孢子虫感染的报道[7],因此相关研究不能很好地反映河北省貉子隐孢子虫感染与虫种/基因型分布的真实情况。鉴于此,本研究对河北省多地人工养殖的貉子进行隐孢子虫的分子流行病学调查,了解貉子中隐孢子虫流行情况并评估其可能蕴含的公共卫生风险,为相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2022年6—12月,分别从河北省石家庄市、邯郸市、秦皇岛市和张家口市等地区的5家貉子场共采集389份新鲜粪便样品。上述养殖场中,貉子均饲养在联排金属笼子中,粪便直接漏到笼子下方的地面上。成年貉子(6月龄以上)一般一笼单只饲养,幼龄貉子分窝前(45～60日龄断奶分窝)和母貉子合笼饲养,分窝后多只合并饲养一段时间后再分笼饲养。采样时从笼具下方的粪堆上部采集新鲜粪便10～20 g,每个笼子仅采1次。粪便装入洁净自封塑料袋中,编号并记录对应采样场、貉子年龄及粪便状况等信息,放置于4 ℃冰箱内冷藏待检。

1.2 主要仪器与试剂

T100型PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司),Tanon1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。粪便DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司),rTaq DNA聚合酶(上海泽叶生物科技有限公司);BIOWESTE琼脂糖(北京沃比森科技有限公司)。本研究所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 粪便基因组提取

依照产品说明书进行操作,提取的DNA保存于-20 ℃冰箱待检。

1.4 隐孢子虫SSU rRNA基因扩增

参照Xiao等[16]的研究,用巢式PCR方法扩增隐孢子虫SSUrRNA基因,引物见表1。2轮PCR反应体系体积相同,依次加入38.55 μL超纯水、5 μL 10×PCR缓冲液、1 μL DNA模板(首轮PCR用提取的貉子粪便基因组DNA,第2轮PCR用首轮PCR产物)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、4 μL 1.25 mmol/L dNTP和0.25 μL 5 U/μL rTaq酶。首轮PCR反应参数设置为94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ l min,共35个循环;72 ℃ 10 min。第2轮PCR除退火温度调整为58 ℃外,其余参数同首轮PCR。用感染隐孢子虫的猪粪便基因组DNA作阳性对照,隐孢子虫阴性猪粪便DNA提取物作阴性对照。

表1 本研究中所用引物Table 1 PCR primers used in the present study

1.5 隐孢子虫gp60基因扩增

参照Jiang等[17]的引物与方法,对获得的隐孢子虫SSUrRNA阳性样本进行隐孢子虫gp60基因的扩增,引物见表1。2轮PCR反应体系体积相同,含1 μL貉子粪便基因组DNA(首轮PCR)或2 μL首轮PCR产物(第2轮PCR)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、5 μL 10×PCR缓冲液、4 μL 1.25 mmol/L dNTP、0.3 μL 5 U/μL rTaq酶、38.50 μL超纯水。2轮PCR反应扩增反应的参数相同,为94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 80 s,共35个循环;72 ℃ 10 min。

1.6 测序与分析

第2轮PCR扩增后,产物进行凝胶电泳分离,所获阳性扩增产物送相关公司,分别用扩增基因的第2对引物从正方和反方进行双向测序。测序序列用Dnaman软件进行编辑,在GenBank数据库中经Blast搜索。为评价所获隐孢子虫虫种/基因亚型的遗传关系,所获序列经Clustal X软件比对,采用最大似然法(Maximum-likelihood Method)在Mega软件中构建进化树,可逆取代模型用于替代率的计算,自展值设为1 000。新发现的隐孢子虫基因亚型根据既定的命名系统命名[15]。

1.7 统计分析

应用SPSS 20.0软件对本研究中的数据进行Fisher's 精确检验分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 河北省貉子隐孢子虫感染情况

389份貉子粪便样本中,基于SSUrRNA基因的巢式PCR方法共检出6份隐孢子虫阳性样品,河北省圈养貉子隐孢子虫感染率为1.5%(6/389)(表2)。隐孢子虫阳性样本分布在邯郸、秦皇岛和张家口貉子养殖场,感染率分别为2.9%(3/103)、2.0%(2/100)和1.2%(1/86),石家庄未检出隐孢子虫阳性样品,不同地区感染率差异无统计学意义(χ2=3.059,P=0.063)。6月龄以上貉子隐孢子虫感染率为1.2%,6月龄以下貉子隐孢子虫感染率为1.6%,二者差异不显著(χ2=0.096,P=0.384)。粪便正常和非正常貉子隐孢子虫感染率分别为0.6%和11.1%,差异显著(χ2=23.18,P=0.001)(表3)。

表3 河北省圈养貉子隐孢子虫感染在不同年龄、粪便类型中的分布情况Table 3 Prevalence of Cryptosporidium spp. among different age, and feces form groups of raccoon dogs in Hebei Province

2.2 貉子隐孢子虫遗传分析情况

对所获得的6份隐孢子虫SSUrRNA基因PCR阳性产物进行测序和比对,显示本研究中得到的6个隐孢子虫SSUrRNA基因序列完全一致,Blast分析显示其均为C.canisSSUrRNA基因,与GenBank中参考序列AF112576有100%同源性。进化构建树显示分离得到的隐孢子虫SSUrRNA基因与已报道的多个C.canis分离株聚为一支,进一步表明本研究中所获得的隐孢子虫虫种为C.canis(图1)。

图1 基于SSU rRNA基因构建的隐孢子虫进化树(最大似然法,可逆取代模型)Fig.1 Phylogeny of Cryptosporidium spp. based on the partial SSU rRNA gene (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲为本研究所获犬隐孢子虫SSU rRNA基因序列。

6份隐孢子虫SSUrRNA基因阳性样本中,5份样本gp60基因被成功扩增和测序,序列经比对,剔除相同序列,得到两个隐孢子虫gp60序列,Blast分析显示其分别与C.canis基因亚型XXa2(登录号为MT954605)和XXa4(登录号为MT954607)序列一致。构建进化树显示分离得到的两个隐孢子虫gp60基因分别与已报道的C.canis基因亚型XXa2(登录号为ON863566和MT954605)和C.canis基因亚型XXa4(登录号为ON863565和MT954607)聚为一支,进一步表明本研究中所获得的两个C.canis其基因亚型分别为XXa2和XXa4(图2)。

图2 基于gp60基因构建的犬隐孢子虫亚型家族进化树(最大似然法,可逆取代模型)Fig.2 Phylogenetic relationship of C. canis gp60 nucleotide sequences (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲为本研究所获犬隐孢子虫gp60基因序列。

2.3 貉子隐孢子虫虫种/基因亚型分布情况

本次调查在河北省圈养貉子中共发现2种C.canis基因亚型,即XXa2和XXa4,分别占总样本的0.5%(2/389)和0.8%(3/389)。除石家庄未检出隐孢子虫阳性样品以及张家口貉子养殖场所获阳性样本测序不成功外,邯郸和秦皇岛貉子养殖场均检出这2种C.canis基因亚型(表2)。

3 结论与讨论

迄今,全球有关貉子隐孢子虫的相关报道不多,且主要集中在中国、日本和波兰等国,已报道的貉子隐孢子虫感染率为2.5%～37.7%[6-8,10,14-15,18]。本研究中,河北省圈养貉子隐孢子虫感染率为1.5%,低于目前相关报道,但高于王步康等[9]关于河北昌黎地区貉子的报道(感染率为0)。本研究中,6月龄以上貉子和6月龄以下貉子隐孢子虫感染率间无显著差异(χ2=0.096,P=0.384),这一结果与Zhang等[8]、Qian等[14]的研究结论一致,但与Wang等[6]、王步康等[9]的研究不一致,分析不同研究中结论不一致的原因,可能与不同研究中所用样本量大小、采样地点、饲养管理及样本处理方法等不同有关。同时,本研究中,粪便不正常貉子隐孢子虫感染率(11.1%)显著高于粪便正常的貉子(0.6%)(χ2=23.18,P=0.001),分析其差异原因可能与动物的饲养环境与卫生管理等相关。

本研究中,C.canis是河北省圈养貉子检出的唯一隐孢子虫虫种,这一结果与中国黑龙江[8]、新疆维吾尔自治区[14]、山东[6]等地的报道一致。C.canis是对人有致病性的5种最常见的隐孢子虫虫种之一,频繁地发生于发展中国家人群[19]。从事貉子等毛皮动物养殖、销售、加工的从业人员应了解该虫种的传播途径等相关知识,做好自身防护,严防出现人畜共患传播。

借助于新近开发的基于gp60基因的分型工具,分析显示河北省圈养貉子感染的C.canis共存在2个基因亚型,即XXa2和XXa4,显示貉子源C.canis具有一定的遗传多样性[17]。此外,XXa2和XXa4基因亚型在美国、秘鲁、埃塞俄比亚和牙买加的人群中已有报道,进一步显示貉子源C.canis具有人畜共患性,应引起高度重视[17]。Wang等[6]等研究显示不同的毛皮动物感染的C.canis基因亚型不同,如貉子主要感染XXa,水貂只感染XXd和XXf,狐狸仅感染XXg,暗示毛皮动物源C.canis如同其他人群中常见的隐孢子虫虫种C.parvum,C.hominis和C.ubiquitum一样,存在明显宿主适应性[20]。未来尚需进一步加大对毛皮动物隐孢子虫流行虫种、传播模式等的研究,以积累更多流行病学数据,进而阐明其隐孢子虫虫种遗传多样性和宿主适应性等特征。