生防菌代谢产物与化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制活性研究

周 慧, 段海明, 杨胜雨, 张 健

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

棉花是我国重要的经济作物之一,其产量一直位于世界前列,然而棉花枯萎病对我国乃至全球范围内的棉花产量与质量均造成严重损失,属于毁灭性病害[1]。棉花枯萎病在棉花整个生育期都会引起危害,苗期会引起棉苗大量死亡,棉花生长后期会导致植株枯萎、铃重减轻,对棉花种子的发芽率、成熟度以及棉花纤维的强度与长度都会产生重要影响,开展该病害的防治措施研究具有重要意义[2]。

目前,棉花枯萎病的防治措施主要以化学防治为主。李海微等[3]得出0.30%四霉素水剂可有效防治南疆地区棉花枯萎病DD11和DD22菌株,抑菌效果分别达97.91%和99.35%;郭明程等[4]研究表明60%吡唑醚菌酯·代森联WG以1 080 g/hm2的剂量防治棉花枯萎病,防效为58.52%～62.84%,并具有促生增产作用;郑德有等[5]发现宁南霉素对棉花枯萎病菌抑制率达68.24%,EC50为8.03 mg/L。生物防治由于绿色无污染而日益引起研究者的重视。戴蓬博等[6]采用生物学特性观察和16S rDNA基因序列分析等方法得出菌株SC11为壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)是一株棉花枯萎病拮抗菌,其防效可达42.51%,且能提高棉花产量。张克诚等[7]进行了室内和田间试验得出了链霉菌(Streptomycesspp.) S-5能有效抑制棉花枯萎病菌,防治效果为66.50%;Hao等[8]从棉花根组织分离得到的内生细菌DG3-1抑制棉花枯萎病同时增加叶绿素含量,鉴定为耐盐农杆菌(Agrobacteriumspp.)。赵莹莹等[9]采用枯草芽孢杆菌KXZ-33发酵液处理种子和地上部喷施10 mg/L的甲基硫菌灵相结合可以提高防治棉花枯萎病的效果;高景凯等[10]从广东石豆兰中筛选内生细菌-枯草芽孢杆菌BK27发酵液,其对棉花枯萎病尖孢镰刀菌萎蔫专化型抑制率为60.78%。化学农药大量过频使用会引起病菌抗药性、药物残留和环境污染等突出问题威胁农产品安全[11]。生物防治对环境无污染,但是对病害发挥效应较为缓慢。因此,化学防治和生物防治结合起来开展棉花枯萎病的防治具有重要意义。本研究开展了8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的室内抑制活性和解淀粉芽孢杆菌所产发酵上清液和脂肽粗提物对病菌的的抑制效果研究,旨在筛选出对棉花枯萎病菌抑制效果较好的化学药剂和生防菌株,从而为后续棉花枯萎病的综合治理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试杀菌剂 95%苯醚甲环唑原药、96%戊唑醇原药、96%腈菌唑原药、96%多菌灵原药、95%甲基硫菌灵原药、97.6%萎锈灵原药、95.6%丙环唑原药由安徽省锦江农化有限公司提供。70%丙森锌可湿性粉剂由拜耳作物科学有限公司提供。多菌灵使用0.1 mol/L HCl溶液配成1.0×104μg/mL,其它杀菌剂原药采用丙酮溶解,配制成1.0×104μg/mL母液,置于4 ℃冰箱中保存备用;丙森锌由灭菌水溶解配制而成。

1.1.2 供试菌株和培养基 棉花枯萎病病菌(Fusariumoxysporiumf. sp.vasinfectum)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06由本研究室提供。供试培养基包括PDA培养基、NA培养基和NB培养基[12]。

1.2 试验方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌的对峙培养 接种环挑取SJ06菌苔接入距PDA平板中心相互垂直2 cm的四点处,再将棉花枯萎病菌菌饼(直径7 mm)接至平板中心,以不接细菌的平板为对照,重复3次,置于26 ℃恒温箱中培养,4 d后测量病菌直径,计算抑制率。

1.2.2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制活性测定 接种解淀粉芽孢杆菌SJ06至NB培养基中,发酵培养时间为72 h。培养结束后以10 000 r/min,4 ℃离心制得发酵上清液分别稀释到不同的浓度,然后取5 mL加入到冷却到50 ℃左右的45 mL PDA培养基充分混匀,使得发酵上清液在PDA培养基中的终浓度分别为6.25、8.33、12.50、25.00和100.00 μL/mL,中央接种病菌后置于26 ℃恒温箱中培养96 h,然后按照十字交叉法测定不同稀释倍数的发酵上清液处理病菌的菌落直径,采用SPSS 13.0软件计算发酵上清液对棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.3 脂肽粗提物的制备及抑制活性测定 采用李宝庆等[13]方法制备脂肽粗提物,将制得的脂肽粗提物稀释不同梯度,取5 mL的脂肽粗提物与冷却到50 ℃的45 mL PDA培养基充分混匀,使得脂肽粗提物的含量分别为673.96、1 015.00、2 030.00、4 060.00、8 120.00 μg/mL。然后计算脂肽粗提液对棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.4 8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的室内毒力测定 测定苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑、丙环唑、萎锈灵、多菌灵、甲基硫菌灵和丙森锌对棉花枯萎病菌的抑制活性,8种化学杀菌剂在PDA中培养基的终浓度见表1。接种完毕后置于26 ℃恒温箱中培养96 h,用十字交叉法测量菌落直径。采用SPSS 13.0软件求出8种化学杀菌剂对病菌的毒力回归方程、EC50值、95%置信区间和R2。

表1 8种化学杀菌剂质量浓度设置Table 1 Concentration gradient of 8 fungicides

2 结果分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌对峙培养结果

由图1可见,菌株SJ06对棉花枯萎病菌抑制效果明显,能抑制病菌菌丝生长,抑制率平均值为78.24%,而且发现生防菌菌株SJ06可以将病原菌完全包围,阻止其进一步发生扩展下一步可进行菌株产发酵上清液和脂肽粗提物对病菌的抑制活性研究。

图1 解淀粉芽孢杆菌SJ06与棉花枯萎病菌对峙结果Fig.1 Effect of confrontation culture between B. amyloliquefaciens SJ06 and F. oxysporum f. sp. vasinfectum注:A为菌株SJ06与病菌对峙结果;B为对照。

2.2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表2可见,解淀粉芽孢杆菌SJ06发酵上清液的浓度从6.25 μL/mL增至100.00 μL/mL,在26 ℃恒温恒湿培养箱中培养96 h对棉花枯萎病菌的抑制率从46.90%增至80.30%,高浓度的发酵上清液对棉花枯萎病菌抑制作用较强(图2)。经SPSS 13.0软件分析得出发酵上清液对棉花枯萎病菌的EC50为7.37 μL/mL(R2=0.95)。

图2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of fermentation supernatant with different dilution times on F. oxysporium f. sp. vasinfectum

表2 不同稀释倍数的发酵上清液对棉花枯萎病菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of different dilution times of B. amyloliquefaciens fermentation supernatant to F. oxysporium f. sp. vasinfectum

2.3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表3、图3可知,脂肽粗提物的浓度从673.96 μg/mL增至8 120.00 μg/mL,在27 ℃恒温恒湿培养箱中培养96 h对棉花枯萎病菌的抑制率从19.90%增至77.30%(表3),分析得出脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的EC50为2 720.20 μg/mL(R2=0.98)。

图3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of crude lipopeptide extracts with different dilution times on F. oxysporium f. sp. vasinfectum

表3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对棉花枯萎病菌的抑制率Table 3 Inhibition rate of different dilution times ofcrude lipopeptide extract to F. oxysporium f. sp. vasinfectum

2.4 8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制活性

由表4可知,棉花枯萎病病菌对戊唑醇的敏感性最高,EC50为0.34 μg/mL,其次为多菌灵,其对病菌的EC50为0.49 μg/mL。苯醚甲环唑和腈菌唑对棉花枯萎病菌的EC50分别为1.34 μg/mL和1.07 μg/mL,丙环唑对病菌的EC50为1.54 μg/mL。甲基硫菌灵对病菌的EC50为7.87 μg/mL,萎锈灵对病菌的EC50为10.65 μg/mL。丙森锌对病菌的抑制活性最差,其EC50为63.25 μg/mL。

3 结论与讨论

棉花枯萎病是棉花生产中的重要土传病害,一旦发病难以防治,对于棉花生产造成了重大威胁[14]。陈淑珍等[15]在棉花现蕾前连续使用10%恶霉灵纳米乳1 500倍液灌根20 d之后对棉花枯萎病菌的防治效果为97.22%。刘春英[16]发现多菌灵对棉花尖孢镰刀菌的EC50是0.06 mg/L;韩新才等[17]采用生长速率法测定了多菌灵对棉花枯萎病菌的抑制活性,EC50达10.30 μg/mL。本研究通过菌丝生长速率法比较了8种化学杀菌剂对棉花枯萎病的抑制活性得出戊唑醇对棉花枯萎病的抑制活性优异,其EC50为0.34 μg/mL;其次多菌灵EC50为0.49 μg/mL,可以看出棉花枯萎病菌对同一种药剂的毒力水平存在较大差异,这与不同来源的菌株有关,所以不同地区的棉花枯萎病的防控推荐用药应根据当地病菌的药敏性作具体分析随着农药使用量零增长以及植病生防的推广,生防菌的使用能够明显减少化学药剂的用量,用于棉花枯萎病的生防菌报道有短小芽孢杆菌[18]、蜡状芽孢杆菌YUPP-10[19]、壮观链霉菌SC11[6]等。李玉洋等[20]采用平板稀释法分离获得一株对棉花枯萎病抑制活性为65.19%的菌株SN06;丁建朋等[21]通过田间试验发现解淀粉芽孢杆菌HFW217对棉花枯萎病的防效达80.97%。张一白等[22]通过田间试验得出奥瑞根(地衣芽孢杆菌制成)可湿性粉剂对棉花枯萎病的防治效果为28.4%～51.5%。余利等[23]将解淀粉芽孢杆菌脂肽粗提物分别与克菌丹质量比1∶100、代森锰锌5∶100时,增效系数SR达1.78和1.74。本试验通过菌丝生长速率法检测解淀粉芽孢杆菌SJ06发酵上清液的10倍稀释液对棉花枯萎病菌的抑制率达80.2%,而脂肽粗提物100倍稀释液对病菌的抑制率达到77.30%,在棉花枯萎病的生物防控方面具有潜在的利用价值。本研究初步探索了生防菌发酵上清液、脂肽粗提物和8种化学杀菌剂对棉花枯萎病菌的抑制效果,为进一步探究化学杀菌剂和生防菌剂的复配及其抑制机理提供了基础数据。