植物激素对铝胁迫下番茄根生长的影响

蔡家辉, 王乾坤, 吴 越, 刘华彬, 祝嫦巍*

(1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100)

铝(Al)是地壳中含量最多的金属元素,在土壤环境中常以无毒的硅酸盐、氧化物的形式存在。在酸性(pH<5.0)土壤中,含铝的硅酸盐、氧化物释放出三价铝离子(Al3+),抑制植物的根系生长发育,减少植物对营养物质的吸收,成为抑制植物生长、限制作物产量的重要因素[1-2]。植物的根尖组织是铝毒害的主要靶位点,根尖转换区(分生区和伸长区之间)是植物对铝毒胁迫最敏感的部位,Al3+主要通过抑制这一组织部位细胞的分裂和伸长来抑制根的生长[3]。在受到铝胁迫时,植物在长期进化和适应环境的过程中形成了内部耐受和外部排斥机制。内部耐受主要是通过液泡的区隔化和有机酸螯合以减弱铝离子对植物细胞的毒害作用;外部排斥则主要通过植物的根系分泌有机酸以螯合根际的铝离子,减少铝离子进入细胞,降低铝对植物的毒害作用[4-5]。

激素作为重要的植物生长调节物质,在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥重要的调控作用。研究发现,水杨酸、茉莉酸、乙烯、细胞分裂素和生长素均参与植物的铝胁迫响应过程。水杨酸(Salicylic Acid,SA)作为内源性信号响应分子,参与植物的逆境胁迫响应过程。对大豆(Glycinemax)外源施加水杨酸可以降低植物根系对铝的吸收,促进根系分泌更多的柠檬酸盐,从而缓解铝的毒害作用,恢复根系生长[6]。50 μmol/L水杨酸可以提高葡萄(Vitisvinifera)根系活力[7]。铝胁迫诱导茉莉酸合成相关基因表达上调,植物体内茉莉酸含量升高。外源施加茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)会加重铝胁迫导致的根生长抑制[8]。此外,铝胁迫还会导致根尖过渡区细胞分裂素信号响应增强,外源施加细胞分裂素(6-Benzylamino purine,6-BA)会增强铝胁迫导致的根生长抑制。研究表明,铝胁迫诱导的根尖细胞分裂素信号响应受到生长素的调控[9]。因此,生长素不仅直接参与调控植物铝胁迫响应过程,还可以通过下游的细胞分裂素信号途径进一步影响植物根的生长。

生长素(Auxin)是植物响应铝胁迫过程中的关键信号调控分子。铝胁迫诱导生长素在根尖分生区和转换区的合成增加,过度积累的生长素进而抑制根的伸长生长[10]。但是,生长素在不同的植物种类中有着不同的调控机制。在拟南芥的生长中,铝胁迫通过影响生长素在根尖的极性运输和本地合成,导致生长素在根尖分生区和转换区细胞的过量积累,高浓度的生长素进而抑制主根的伸长生长[11]。但是在玉米(Zeamays)的生长中,铝处理会使根尖生长素含量降低,抑制玉米根系生长,但外源施加NAA可缓解铝胁迫导致的玉米根生长抑制[12]。铝胁迫下生长素在拟南芥和玉米根系生长中起到截然不同的作用,这可能是由于生长素在双子叶植物和单子叶植物响应铝毒胁迫过程中发挥着不同的调节机制。

本试验以番茄(Solanumlycopersicum)为研究材料,探究不同植物激素和植物生长调节剂对铝胁迫下番茄根生长的影响,利用生长素报告基因DR5:GUS探究番茄根部生长素对铝胁迫的响应机制,同时通过活性氧和细胞死亡检测研究根部细胞与铝胁迫之间的相互作用,为在酸性土壤环境下番茄耐铝种植提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为栽培品种矮生番茄,由甘肃甘益农种业有限公司生产;本试验所用Micro-Tom背景的DR5:GUS转基因番茄是由DR5:GUS转基因番茄(VF36背景,由齐明芳教授提供)通过与Micro-Tom回交4次获得[13]。

1.2 试验方法

1.2.1 植物培养 番茄种子使用1%NaClO溶液消毒10 min,无菌水冲洗5遍,播种在1/2MS培养基上避光萌发。萌发后选取生长一致、根长为(35±5) mm的番茄幼苗转移至1/5Hogland营养液中,放置在人工气候培养箱内培养,光照16 h/24 ℃,黑暗8 h/20 ℃,相对湿度为70%,光照强度为10 000 lx。

1.2.2 AlCl3处理 每组处理挑取10株生长一致的番茄幼苗,在0.5 mmol/L CaCl2溶液中预处理12 h,转移到含不同浓度AlCl3(0、25、50、75、100 μmol/L)的1/5Hogland营养液中培养,每2天更换1次营养液,并保证每次所换溶液pH为5.0。第6天使用扫描仪扫描拍照,用Image J软件测定根长。

1.2.3 激素处理 每组处理挑取10株生长一致的番茄幼苗,在0.5 mmol/L CaCl2溶液中预处理12 h,转移到含有50 μmol/L AlCl3和不同植物生长调节剂(6-BA、BL、SA、MeJA、NAA、yucasin、NPA或TIBA)的1/5Hogland营养液中培养,营养液每2天更换1次,并保证每次所换溶液pH为5.0。培养至第6天时使用扫描仪扫描拍照,用Image J软件测定根长。

1.2.4 GUS染色 量取5 mL无菌水和5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.0),加入100 μL X-Gluc、50 μL铁盐及10 μL Triton X-100,混匀,避光储存,获得GUS染液。将铝胁迫处理3 h后的番茄幼苗放入GUS染液中,37 ℃避光染色12 h,使用透明剂(水合氯醛∶无菌水∶甘油=8∶3∶1,V∶V∶V)透明,高级正置荧光显微镜拍照。

1.2.5 苏木精染色 称取0.5 g苏木精、0.05 g KI,溶于100 mL蒸馏水,配制苏木精染液。将番茄幼苗在含0.5 mmol/L CaCl2溶液中预处理12 h,转移到1/5Hogland营养液中,设置对照组(CK),处理组分别设置25 μmol/L AlCl3(Al)、25 μmol/L AlCl3+50 nmol/L NAA (Al+NAA)、25 μmol/L AlCl3+4 μmol/L NPA(Al+NPA)、25 μmol/L AlCl3+4 μmol/L TIBA (Al+TIBA)、25 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin(Al+yucasin),处理30 min,处理后的番茄幼苗经过无菌水冲洗干净,放入苏木精染液中染色5 min,蒸馏水中冲洗5遍后使用显微镜观察拍照。

1.2.6 活性氧检测 配制1 mg/mL DAB染液。取生长一致的番茄幼苗经过50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin共同处理2 h,无菌水冲洗干净,放入DAB染液中避光染色10 min,使用透明剂进行透明,高级正置荧光显微镜拍照。

1.2.7 细胞凋亡检测 称取10 g苯酚,分别量取甘油、乳酸、无菌水各10 mL,混匀,称取10 mg台盼蓝溶于混匀液配制成台盼蓝染色液。选取生长一致的番茄幼苗经过50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin共同处理12 h,台盼蓝染色5 min,使用透明剂进行透明,显微镜拍照观察。

1.3 数据分析

所有处理均进行至少3次独立生物学重复试验,使用GraphPad Prism 9.0进行数据处理和作图(平均值±标准差),使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析,使用Adobe Illustrator CC 2017进行组图,采用Duncan检验法进行各处理间显著性差异分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 铝胁迫抑制番茄根的生长

为探究铝胁迫对番茄幼苗根生长的影响,外源施加不同浓度的AlCl3进行处理,分析番茄幼苗根长。番茄幼苗在不同铝胁迫处理下培养6 d(图1A),结果显示,低浓度的铝胁迫(10、25 μmol/L AlCl3)处理对番茄根的生长没有明显抑制作用,当浓度达到50 μmol/L时,番茄幼苗主根生长明显受到抑制,且随着铝浓度的增加,铝诱导的根生长抑制越严重(图1B)。

图1 不同浓度AlCl3对番茄根生长的影响Fig.1 Effects of different concentrations of AlCl3 on tomato root growth注:比例尺=10 mm;不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。下同。

2.2 不同激素对铝胁迫下番茄根生长的影响

为探究不同激素对铝胁迫下番茄根生长的影响,外源施加细胞分裂素(6-BA)、油菜素内酯(BL)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)分别与50 μmol/L AlCl3共同处理番茄幼苗,分析不同的植物激素在番茄铝胁迫过程中的作用。结果表明,低浓度(0.5、1、2 nmol/L)的6-BA处理对铝胁迫下根的生长没有明显影响,较高浓度(5 nmol/L)的6-BA加重铝胁迫诱导的根生长抑制(图2A、B)。尽管较低浓度(0.1 nmol/L)的BL对铝胁迫诱导的根生长抑制有所缓解,但是外源施加BL并不能显著缓解铝胁迫对番茄的抑制作用(图2C、D)。低浓度(5、10 μmol/L)的外源SA对铝胁迫下根的生长没有明显影响,较高浓度(20、40 μmol/L)的SA加重铝胁迫诱导的根生长抑制(图2E、F)。低浓度的外源MeJA不影响番茄根对铝胁迫的敏感性,随着MeJA浓度的增加,番茄响应铝胁迫的敏感性增强,铝诱导的根生长抑制出现加重的现象(图2G、H)。

2.3 生长素在番茄铝胁迫响应过程中的作用

为探究生长素在番茄铝胁迫过程中的作用机制,通过外源施加生长素类似物(NAA)、生长素合成抑制剂(yucasin)、生长素运输抑制剂(NPA、TIBA),分析其对铝胁迫下番茄根生长的影响。试验发现,当外源施加NAA时,铝胁迫诱导的番茄根生长受到明显影响,随着外源NAA浓度的增加而加重(图3A、B)。当外源施加生长素合成抑制剂yucasin时,铝胁迫诱导的根生长抑制现象得到明显缓解,且较低浓度即可有效减弱铝胁迫对番茄根的毒害作用(图3C、D)。当外源施加生长素运输抑制剂NPA或TIBA时,铝胁迫诱导的根生长抑制现象也明显随着外源抑制剂浓度的增加而加重(图3E～H)。

图3 生长素对铝胁迫下番茄根生长的影响Fig.3 Effects of auxin on tomato root length under aluminum stress

2.4 铝诱导根尖生长素含量的增加

为进一步探究生长素合成途径如何参与番茄铝胁迫响应过程,试验利用生长素报告基因DR5:GUS分析铝胁迫对番茄根尖生长素响应的影响。结果显示,铝(25 μmol/L AlCl3)处理诱导生长素在番茄根尖分生区、转换区和侧根冠积累,外源施加yucasin处理明显减少铝胁迫诱导的生长素在根尖的积累(图4)。结果表明,铝胁迫通过诱导根尖生长素的积累抑制根的伸长生长,而外源yucasin可以通过减少生长素的积累缓解铝胁迫导致的生长抑制。

图4 外源yucasin对铝胁迫下番茄根尖生长素响应的影响Fig.4 Effects of exogenous yucasin on auxin response to aluminum stress in tomato root tips注:比例尺=200 μm。

2.5 外源yucasin减少铝在根部的积累

为分析yucasin在番茄铝胁迫下的作用,试验进一步检测了铝离子在根部的积累情况。结果发现,与CK相比,25 μmol/L AlCl3处理后番茄根尖组织染色较深,表明有大量的铝离子积累(图5)。外源施加50 nmol/L NAA、4 μmol/L NPA 和4 μmol/L TIBA分别与25 μmol/L AlCl3共同处理后,染色加深,表明根尖组织积累更多的铝离子(图5)。外源施加10 μmol/L yucasin与25 μmol/L AlCl3共同处理后,染色明显减弱,表明铝离子在根尖组织的积累减少(图5)。结果表明,外源生长素或生长素运输抑制剂均可增加铝离子在根尖的积累,从而加重铝胁迫对根的毒害作用;而生长素合成抑制剂可以减少铝离子在根尖的积累,从而缓解铝胁迫对根的毒害。

图5 外源生长素及相关抑制剂对番茄根尖铝离子积累的影响Fig.5 Effects of exogenous auxin and related inhibitors on Al accumulation in tomato root tips注:比例尺=100 μm。

2.6 铝胁迫对番茄根部活性氧和细胞死亡的影响

活性氧(ROS)的产生是植物响应逆境胁迫的重要信号分子,为分析生长素合成途径对铝胁迫下ROS产生的影响,通过外源施加yucasin检测铝胁迫下ROS的积累情况。结果表明,与CK相比,50 μmol/L AlCl3处理导致ROS在番茄根尖分生区和转换区积累,特别是转换区组织细胞中有大量的ROS积累,这也表明转换区是根对铝胁迫更为敏感的区域(图6A)。外源施加yucasin可以明显减少ROS在根尖的积累,减弱铝胁迫对根尖组织的伤害(图6A)。通过台盼蓝染色观察发现,铝胁迫处理导致根尖组织细胞染色明显加深,yucasin可以减弱根尖的染色,表明yucasin可以缓解铝胁迫导致的根尖组织细胞的死亡(图6B)。

图6 外源yucasin对铝胁迫下番茄根尖细胞活性氧产生(A)和细胞死亡(B)的影响Fig.6 Effect of exogenous yucasin on reactive oxygen species production (A) and cell death (B) in tomato root tip cells under aluminum stress注:比例尺=200 μm。

3 结论与讨论

植物激素在植物的生长发育和铝胁迫响应过程中起到重要调控作用[14]。研究发现,细胞分裂素响应基因ARR3和ARR4受到铝胁迫的诱导,铝处理会诱导细胞分裂素在根尖组织过多积累[9]。本研究发现外源施加细胞分裂素(6-BA)会进一步加重铝胁迫导致的番茄根生长抑制(图2A)。外源施加油菜素内酯(BL)会加重铝胁迫诱导的根生长抑制,而油菜素内酯合成抑制剂(PPZ)则可以缓解铝胁迫导致的根生长抑制[15-16]。本试验中,发现低浓度的BL对铝胁迫导致的根生长抑制有所缓解,而随着BL浓度的增加,铝胁迫导致的根生长抑制并没有得到缓解,且侧根数明显减少(图2C),这表明低浓度的外源BL可以提高番茄的耐铝能力,而高浓度的BL会加重铝胁迫对植物的伤害。水杨酸是植物响应逆境胁迫的关键信号分子[17]。水杨酸过量积累的拟南芥突变体snc1表现出对铝胁迫的高敏感性,而水杨酸积累减少的拟南芥转基因植株NahG则对铝胁迫有一定的耐受性[18]。当外源施加水杨酸时,铝胁迫诱导的根生长抑制更加严重(图2E),表明SA在植物的铝胁迫过程中发挥负调控作用。尽管如此,在对大豆幼苗外源施加水杨酸则缓解了铝对植株的毒害作用,降低了大豆根尖的铝含量,提高了大豆的铝毒抗性[6]。因此,可以推测这可能是由于在不同植物中水杨酸参与植物铝胁迫的调控机制存在差异导致的。茉莉酸是植物应对生物及非生物胁迫的重要调节因子[19]。COI1是茉莉酸信号途径中的关键受体,与野生型拟南芥相比,coi1-2功能缺失突变体对铝胁迫的敏感性降低,外源施加茉莉酸甲酯则加重铝胁迫导致的根生长抑制[8]。与此一致的是,外源施加茉莉酸甲酯同样增加番茄对铝胁迫的敏感性,加重铝胁迫导致的根生长抑制(图2G),表明茉莉酸在植物的铝胁迫响应过程中发挥负调控作用。

研究表明生长素参与调控植物铝胁迫响应过程,生长素在不同的植物中发挥不一样的调控功能[11-12]。铝胁迫处理导致玉米根尖生长素的积累减少,根的伸长生长受到抑制,外源施加NAA后根的生长得到显著缓解[12]。然而,外源施加NAA会加重铝胁迫下拟南芥根的抑制,生长素积累过量的相关突变体yucca、sur2和sur1-3在铝处理后也出现了严重的根生长抑制[20]。与此一致的是,本研究也发现外源施加NAA会加重铝胁迫对番茄主根的生长抑制(图3A)。当施加生长素合成抑制剂(yucasin)处理时,铝胁迫诱导产生的根生长抑制得到显著缓解(图3C)。进一步研究表明yucasin处理减少了铝胁迫诱导的生长素在根尖的积累(图4),这与对拟南芥的研究结果一致[15]。生长素运输抑制剂NPA和TIBA处理均会加重铝诱导的番茄根生长抑制(图3E、G)。而对玉米的研究则表明生长素极性运输途径相关突变体zmpgp1表现出对铝毒胁迫的不敏感[12]。通过苏木精染色,表明铝诱导的根伸长生长与铝离子在植物根尖的积累有关。在玉米中,zmpgp1突变体或NAA处理后的根尖铝离子积累明显减少[21]。在番茄中,外源施加NPA、TIBA或NAA处理均会导致铝离子在根尖的积累增加而加重铝胁迫对植物的伤害,外源施加yucasin可以降低铝离子在根尖的积累而减轻铝胁迫伤害(图5)。以上结果也表明,在不同的植物种类中,生长素的调控机制也不尽相同。然而,其中深入的分子机制还需要进一步的研究。

ROS是植物响应逆境胁迫的重要信号分子,植物体内ROS的产生及清除处于动态平衡状态。在植物受到铝胁迫时,ROS的产生和积累增加,从而引发细胞程序性死亡等级联反应[22]。本研究中,铝胁迫导致番茄根尖ROS积累增加,细胞死亡增多,外源施加yucasin可以明显减少ROS的积累和细胞死亡,缓解铝胁迫对植物根尖造成的伤害(图6)。本研究通过生长素合成途径探究植物响应铝胁迫的调控机制,从铝离子的积累、ROS的产生和细胞死亡等方面解析生长素参与调控植物铝胁迫的途径,以期为提高番茄的耐铝能力提供理论依据。