大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能

孙红叶, 朱梦男, 姚改芳, 张 华, 金日生

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230009)

大豆磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)即磷脂酰胆碱水解酶,是一种高效的生物酶催化剂,催化大豆卵磷脂(PC)水解产生胆碱和磷脂酸(PA)[1-3],但高温、极端的pH及有机溶剂会破坏酶蛋白的自身结构,导致其催化效率降低[4-5];且反应结束后,游离酶很难回收和再利用,导致生产成本增加[6-7],使得酶促反应发展十分缓慢。研究发现固定化技术可以解决上述游离PLD所存在的问题[8]。固定化酶的方法和载体是影响酶比活和固定化速率的两个重要因素[9]。研究表明固定化后的PLD对pH的耐受性、热稳定性、储藏稳定性和运行稳定性都得到了明显的提升[10-11]。近几年纳米及带有多孔材料的载体成为了固定化酶的研究热点[12]。由于介孔二氧化硅具有易于合成、可调节的孔径、较大的比表面积、化学和力学特性稳定、生物相容性优异等特点,被广泛应用到固定化酶中[13-14]。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)在自然界中的含量极低[15-16],目前,其合成最有效的方法是利用PLD的转磷脂酰化反应在水-有机界面以大豆卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物进行催化合成[17-18]。由于酶转化法合成PS发生在水-有机体系中,游离磷脂酶D与有机溶剂接触会造成酶分子的变性,酶活性降低,导致催化合成PS的产率降低[19-20]。此外,游离酶不易回收利用,会使PS的生产成本增加[21]。

因此,本研究首先通过非极性溶剂辅助Stöber法制备纳米级介孔二氧化硅作为固定化酶的载体,通过吸附-沉淀-交联方式将PLD固定到介孔二氧化硅表面,优化固定化条件并对固定化后的PLD进行结构表征和热稳定性及贮存稳定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物催化合成PS,并确定最佳合成工艺;最后对固定化PLD的循环使用性能进行研究,旨在通过固定化技术提高PLD的稳定性及催化性能,增加合成PS的产率,并实现磷脂酶D的回收重复使用,降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

STA449F5同步热分析仪(德国耐驰有限公司);Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞世尔有限公司);Masterizer 2000激光粒度分析仪(上海善福电子科技有限公司);JEM-400 La B6透射电子显微镜(日本电子公司);高分辨场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi公司);QuadraSorb SI(美国康塔仪器公司);UV-1600紫外分光光度计(上海菁华仪器有限公司);Agilent-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)。

1.2 试剂与材料

卵磷脂(纯度为84.80%)由实验室制备;磷脂酶D(蛋白含量为8.12×10-4μmol/g protein)、胆碱标准品(纯度为98.00%)、磷脂酰丝氨酸标准品(纯度为98.00%)和L-丝氨酸均购于美国sigma公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清蛋白(BSA)和乙酸钠均购于上海阿拉丁试剂有限公司;甲醇和异丙醇为色谱纯,均购于美国sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 介孔二氧化硅的制备 参考非极性溶剂辅助Stöber法制备介孔二氧化硅的方法[22]。称取1.00 g CTAB置于三角瓶中,加入160.00 mL去离子水完全溶解;加入8.00 mL(25.00%～28.00%)氨水溶液,搅拌到溶液澄清透明;缓慢加入5.00 mL正硅酸四乙酯和20.00 mL正己烷的混合溶液;在35 ℃下200 r/min磁力搅拌器中将上述混合液搅拌成白色乳液状之后,继续搅拌12 h。反应结束后,在6 000 r/min下离心10 min,收集固体,将收集的固体分别用无水乙醇和去离子水清洗3次,在真空干燥箱中40 ℃干燥12 h,收集固体;将收集的固体置于550 ℃马弗炉中高温煅烧6 h,将模板剂CTAB脱除,即得介孔二氧化硅。

1.3.2 介孔二氧化硅的结构表征 将介孔二氧化硅在180 ℃的真空中至少脱气6 h后,使用QuadraSorb SI分析仪测定介孔二氧化硅的比表面积、气孔体积及孔径。采用KBr压片法测定介孔二氧化硅的红外官能团,扫描波长为4 000～400 cm-1,扫描次数为64次。将介孔二氧化硅干燥后,在加速电压为200 kV的场发射扫描电子显微镜(SEM)下观察并拍照。将介孔二氧化硅分散在乙醇溶液中,在透射电子显微镜(TEM)下观察并拍照。将介孔二氧化硅均匀分散在去离子水中并采用Masterizer 2000马尔文粒度分析仪测定介孔二氧化硅的粒径大小并绘制曲线图。

1.3.3 PLD的固定 称取0.25 g介孔二氧化硅,加入7.50 mL 20 mmol/L pH 6.50的乙酸钠-醋酸缓冲溶液溶解;加入1.00 mL 20 mmol/L pH 5.50的PLD酶液,置于35 ℃下先物理吸附2 h,加入5.00 mL乙醇沉淀剂,冰浴1 h,将物理吸附未吸附的PLD分子固定在介孔二氧化硅的表面上;最后加入0.40 mL 25%戊二醛交联剂,交联1.5 h,在6 000 r/min下离心10 min,收集固体,用pH 6.50乙酸钠-醋酸缓冲溶液洗涤3次,在真空干燥箱中35 ℃干燥12 h,收集固体,得到固定化PLD。

1.3.4 PLD酶活性的测定 PLD酶活性的测定是根据D'Arrigo等[23]报道的方法,通过检测磷脂酰对硝基苯酚(PpNP)在405 nm水解产生的对硝基苯酚来测定磷脂酶D的活性。取50 μL反应混合液(5 mmol/L SDS, 10 mmol/L PpNP和5% Triton X-100在10 mmol/L Tris/HCl, pH 8.00),加入400 μL(0.10 mol/L, pH 6.00,含2 mmol/L CaCl2)乙酸钠-醋酸缓冲液和50 μL 2 mg/mL游离PLD溶液;在30 ℃下反应10 min,加入100 μL(pH 8.00, 1.00 mol/L Tris/HCl含0.10 mol/L EDTA)缓冲液终止反应。在405 nm处测定磷脂酶D的酶活性;酶活性的一个单位(U)定义为在合适的检测条件下,1 min内磷脂酶D释放1.00 μmol对硝基苯酚的量。固定化磷脂酶D酶活性的终止反应通过将固定化酶从反应中移除来实现。

1.3.5 固定化PLD蛋白固定化率的测定 酶蛋白的固定化率公式如下:蛋白固定化率=(初始酶液总蛋白-固定后残余酶液总蛋白)÷初始酶液总蛋白。根据Bradford法测定酶液中蛋白质含量[24]。以牛血清蛋白(BSA)的浓度为横坐标,595 nm测得的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。取1 mL酶液加入到10 mL考马斯亮蓝溶液中并充分混合均匀,在紫外吸收波长为595 nm处测定吸光度。根据标准曲线即可计算PLD中蛋白质的浓度。每组试验平行做3次以减少酶液中蛋白质含量测定的试验误差。

1.3.6 固定化PLD的单因素试验 根据预试验结果,以相对酶活性和固定化速率为指标,以沉淀剂(甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇及PEG6000)、最佳沉淀剂加入量(2、3、4、5、6 mL)、温度(30、35、40、45、50 ℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、酶液体积(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL)、戊二醛体积(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL)作为单因素对固定化PLD的固定化条件加以研究。

1.3.7 固定化PLD的结构表征 采用KBr压片法测定介孔二氧化硅及固定化后磷脂酶D的介孔二氧化硅红外光谱,扫描波长为4 000～400 cm-1,扫描次数为64次。对介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅进行热重分析。样品量为6～8 mg,Al2O3坩埚,温度区间为30～800 ℃,升温速率为10 ℃/min,保护气为N2,气体速率为20 mL/min。

1.3.8 磷脂酶D的稳定性 将游离和固定化PLD置于20～70 ℃下,每隔10 ℃保温20 min后取出一定量的酶液,对其进行酶活性测定。将游离和固定化PLD分别在4 ℃下贮存50 d,每隔5天取出一定量的酶液,对其进行酶活性测定。

1.3.9 PS的制备 称取20.00 mg磷脂酰胆碱溶解在12 mL乙酸乙酯中;称取160 mg L-丝氨酸,加入2 mL pH 6.50的乙酸钠-醋酸缓冲溶液溶解,加入35%的固定化PLD;将水相和有机相混合置于40 ℃的恒温摇床中反应12 h,并每隔2 h从摇床中取出一定量的反应液用HPLC检测,并根据标准曲线计算PS的产率。反应结束后,离心收集反应液,回收固定化PLD;将反应液低温浓缩后冷冻干燥,得到PS产物。

1.3.10 PS产率的测定 称取适量PS产物用5.00 mL甲醇溶解后倒入棕色容量瓶中,用甲醇定容至25.00 mL,0.22 μm有机膜过滤后HPLC上机检测。色谱条件:柱温为35 ℃,紫外吸收波长为205 nm,以异丙醇∶甲醇∶水(64∶26.4∶9.6,V∶V∶V)作为流动相等度洗脱,进样量为20 μL,流速为0.50 mL/min时,采用Eclipse Plus C18(4.60 mm×250 mm,5 μm)色谱柱分离。以PS的峰面积为纵坐标,PS的浓度为横坐标绘制标准曲线,根据标准曲线计算PS的产率。

1.3.11 PS产率的单因素试验 根据预试验结果,以磷脂酰丝氨酸产率为指标,以有机相(己烷、乙醚、石油醚和乙酸乙酯)、缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸一氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸钠-醋酸和Tris-盐酸)、温度(25、30、35、40、45 ℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、底物质量比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、两相体积比(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)作为单因素对磷脂酰丝氨酸合成条件加以研究。

1.3.12 固定化PLD的循环使用性研究 在相同的反应条件下测定游离PLD与固定化PLD分别在循环使用(1、2、3、4、5、6、7次)后的PS产率。

2 结果与分析

2.1 介孔二氧化硅的结构表征

在相对压力为0.04～1.00、测定温度为77 K时,介孔二氧化硅的N2吸附-解吸等温线如图1A所示,该等温线符合IUPAC定义的IV型等温线[25];根据测定结果计算介孔二氧化硅的总孔隙体积为1.35 cm3/g,表明介孔二氧化硅材料的孔隙率比较大;根据Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法计算介孔二氧化硅的BET比表面积为948 m2/g。根据图1B吸附分支采用BdB球形模型计算出介孔二氧化硅的孔径为8.20 nm,孔径分布比较窄。介孔二氧化硅具有较大的BET比表面积、气孔体积以及与磷脂酶D(7.60 nm×4.80 nm×5.70 nm)[11]相近的孔径大小,不仅有利于吸附更多的酶分子,还不容易造成酶分子在载体上的脱落。介孔二氧化硅的粒径测定结果如图1C所示,介孔二氧化硅的粒径分布为100～1 000 nm,其平均粒径为335.10 nm。介孔二氧化硅的粒径大小检测结果趋于正态分布,而且曲线范围较为集中,说明非极性溶剂辅助Stöber法制备的介孔二氧化硅粒径比较均一。介孔二氧化硅的红外光谱如图1D所示,460 cm-1和800 cm-1附近的波段属于Si—O—Si的弯曲振动峰和对称拉伸,950 cm-1处的吸收峰为Si—OH弯曲振动,1 080 cm-1周围存在强烈的吸收带,对应Si—O—Si的不对称拉伸振动。3 429 cm-1处的吸收峰为O—H键的振动吸收峰。胡盛[26]研究得知CTAB的2个主要红外吸收峰分别为2 870 cm-1和2 950 cm-1,而图1D的红外光谱中没有这2个红外吸收峰,证明CTAB模板剂经马弗炉高温煅烧被脱除。介孔二氧化硅的扫描电镜图和透射电镜图分别如图1E、1F所示,介孔二氧化硅表面存在气孔结构,且介孔二氧化硅具有均匀的微球形结构可以为固定化磷脂酶D提供良好的固定化条件。

图1 介孔二氧化硅的比表面积(A)、气孔体积及孔径(B)、粒径分布(C)、红外光谱图(D)、扫描电镜图(E)和透射电镜图(F)Fig.1 Measurements of specific surface area (A), pore volume and pore size (B), particle size distribution (C), infrared spectrum (D), SEM (E) and TEM (F) of mesoporous silica

2.2 沉淀剂和最佳沉淀剂加入量对PLD酶活性的影响

研究表明,在固定PLD时使用不同的沉淀剂会影响相对酶活性,使用沉淀剂不当时还会造成酶蛋白分子发生不可逆的失活[11]。当温度为30 ℃、pH为6.00、酶液加入量为0.60 mL、物理吸附时间为2.00 h、戊二醛加入量为0.60 mL、交联时间为1.50 h时,研究甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇及PEG6000作为沉淀剂对PLD相对酶活性的影响。结果如图2A所示,当选用乙醇作为沉淀剂时,磷脂酶D的相对酶活性为最大值(85.30%±0.60%);而其它几种沉淀剂对磷脂酶D的相对酶活性都比乙醇作为沉淀剂时要低。因此,选取乙醇作为固定PLD的最佳沉淀剂。确定了最优沉淀剂之后,还需要对沉淀剂的加入量进行优化。当温度为30 ℃、pH为6.00、酶液加入体积为0.60 mL、物理吸附时间为2 h、戊二醛加入体积为0.60 mL、交联时间为1.50 h,乙醇作为沉淀剂时,研究乙醇加入量对固定化PLD相对酶活性的影响。结果如图2B所示,随着乙醇沉淀剂加入量的增加,PLD的相对酶活性先上升后降低,在乙醇沉淀剂加入量为5.00 mL时达到最大值86.30%±0.50%。综上所述,乙醇沉淀剂最佳加入量为5.0 mL。

图2 不同沉淀剂(A)和最佳沉淀剂乙醇加入量(B)对PLD酶活性的影响Fig.2 Effects of different precipitating agents (A) and optimal precipitating agent ethanol volume (B) on the enzymatic activity of PLD

2.3 温度和pH对固定化PLD的影响

当pH为6.00、酶液加入体积为0.60 mL、物理吸附时间为2 h、戊二醛加入体积为0.60 mL、交联时间为1.50 h、乙醇加入量为5.00 mL时,研究温度对固定化PLD的影响。试验结果如图3A所示,固定化PLD的相对酶活和蛋白固定化率均随着温度的升高先上升后下降。当温度为35 ℃时,固定化酶的相对酶活性和蛋白固定化率均达到最大值,分别为86.50%±0.70%和81.80%±0.60%。当固定化温度为50 ℃时,PLD的固定化速率及相对酶活性还分别为68.22%和72.77%,说明固定化技术提升了PLD对温度的耐受性。当温度为35 ℃、酶液加入体积为0.60 mL、物理吸附时间为2 h、戊二醛加入体积为0.60 mL、交联时间为1.50 h、乙醇加入量为5.00 mL时,研究pH对固定化PLD的影响。结果如图3B所示,固定化PLD的相对酶活性和蛋白固定化率均随着pH的增大先升高后降低。当pH为6.50时,固定化PLD的相对酶活性和蛋白固定化率均达到最大值,分别为87.27%±0.80%和82.57%±0.60%。综上可知,在温度为35 ℃、pH为6.50时,固定化PLD的蛋白固定化率和相对酶活性都达到最大值。

图3 温度(A)和pH(B)对固定化PLD相对酶活性和蛋白固定化率的影响Fig.3 Effects of temperature (A) andpH (B) on the relative enzyme activity and protein immobilization rate of immobilized PLD

2.4 酶液和戊二醛加入量对固定化PLD的影响

在温度为35 ℃、pH为6.50、物理吸附时间为2 h、戊二醛加入体积为0.60 mL、交联时间为1.50 h、乙醇加入量为5.00 mL时,研究酶液加入体积对固定化PLD的影响。结果如图4A所示,当酶液加入体积为0.60 mL时,蛋白固定化率达到最大值(85.37%±1.10%)。当酶液加入体积为1.00 mL时,相对酶活性达到最大值(87.62%±1.20%)。当酶液加入体积过大时,PLD在介孔二氧化硅表面的排布会出现多层聚集、传质阻力增大的现象,会导致PLD的相对酶活性下降,且由于介孔二氧化硅的比表面积有限,酶液加入体积过多也会使部分游离的PLD不能固定在介孔二氧化硅上,导致蛋白固定化率降低。因此,当酶液的加入体积为1.00 mL时,相对酶活性达到最大;当酶液的加入体积为0.60 mL时,蛋白固定化率达到最大值。在温度为35 ℃、pH为6.50、物理吸附时间为2 h、酶液加入体积为1.00 mL、交联时间为1.50 h、乙醇加入体积为5.00 mL时,研究戊二醛交联剂加入体积对固定化PLD的影响。结果如图4B所示,当戊二醛加入体积为0.40 mL时相对酶活性达到最大值88.89%±1.00%;当戊二醛加入量为1.00 mL时蛋白固定化速达到最大值86.36%±1.30%。综上可知,戊二醛加入体积为0.40 mL时,相对酶活性最大;戊二醛加入体积为1.00 mL时,蛋白固定化率最大。

图4 酶液(A)和戊二醛(B)加入量对固定化PLD相对酶活性和蛋白固定化率的影响Fig.4 Effects of enzyme solution amount (A) and addition volume of glutaraldehyde (B) on the relative enzyme activity and protein immobilization rate of immobilized PLD

2.5 固定化PLD的结构表征

固定化PLD的红外光谱及热重分析如图5所示,图5A为介孔二氧化硅固定化PLD的红外光谱图,460 cm-1和800 cm-1附近的波段属于Si—O—Si的弯曲振动和对称拉伸,950 cm-1处的吸收峰为Si—OH弯曲振动,1 080 cm-1周围存在强烈的吸收带对应Si—O—Si的不对称拉伸振动;这4个吸收峰也是介孔二氧化硅和介孔二氧化硅固定化PLD所共有的吸收峰。肽键的红外吸收峰分别为1 580 cm-1和1 620 cm-1[27],而介孔二氧化硅固定化PLD有1 580 cm-1和1 620 cm-1红外吸收峰,表明PLD被固定在介孔二氧化硅载体上。图5B为介孔二氧化硅固定化PLD的热重分析(TGA),在30～100 ℃时,介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅均发生了下降,分别下降了4.90%和8.10%,这一部分的损失是因为介孔二氧化硅中水分的蒸发。在100～500 ℃时,介孔二氧化硅的TGA曲线趋于一条直线,说明在该温度范围内介孔二氧化硅的质量没有损失;但介孔二氧化硅固定化的PLD的TGA曲线的质量却下降了5.30%,这一部分的损失可以归结为酶蛋白的损失,通过TGA再次验证PLD被固定在介孔二氧化硅载体上。

图5 固定化PLD的结构表征Fig.5 Structural characterization of immobilized PLD注:A为FT-IR;B为TGA。

2.6 固定化PLD的稳定性

PLD的热稳定性和贮存稳定性的测定结果如图6所示,固定化PLD和游离PLD的初始酶性活均为100%。从20 ℃开始,每隔10 ℃取出一定量的酶液,分别测定游离及固定化磷脂酶D的相对酶活性。其结果如图6A所示,在70 ℃时,固定化PLD的相对酶活性依然有66.40%;而游离PLD的相对酶活性只剩余15.30%。将游离及固定化PLD分别在4 ℃冰箱下贮存50 d,每隔5天取出一定量的酶液,分别测定游离及固定化磷脂酶D的相对酶活性。其结果如图6B所示:游离的PLD在贮存50天时相对酶活性只剩余17.30%;而固定化PLD在贮存50 d时相对酶活性依然保留50.10%;固定化后的PLD的半衰期由20 d增加到了50 d。

图6 固定化PLD的稳定性(A:热稳定性;B:贮存稳定性)Fig.6 Stability of immobilized PLD (A: thermal stability; B: storage stability)

2.7 有机溶剂和缓冲溶液对PS产率的影响

当选用水-有机体系作为合成磷脂酰丝氨酸的反应体系之后,需要对有机相进行筛选。当卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、温度为35 ℃,pH为6.00、有机相与水相的比为4∶1、固定化PLD的加入量为35%时,研究有机相对PS产率的影响。结果如图7A所示,当选用己烷、石油醚、乙醚和乙酸乙酯作为有机试剂时,PS的产率分别为52.30%±1.40%、47.60%±1.60%、83.40%±1.70%和80.80%±1.50%。因乙醚比乙酸乙酯毒性高,所以选择乙酸乙酯作为合成磷脂酰丝氨酸的有机相。当卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、温度为35 ℃、pH为6.00、有机相与水机的比为4∶1、固定化PLD的加入量为35%时,研究缓冲溶液对PS产率的影响。结果如图7B所示,当选用乙酸钠-醋酸作为缓冲溶液时,磷脂酰丝氨酸的产率达到最大值(82.20%±1.50%),因此选取乙酸钠-醋酸作为合成磷脂酰丝氨酸产率的缓冲溶液。

图7 有机溶剂(A)和缓冲溶液(B)对PS产率的影响Fig.7 Effects of organic (A) and buffer solution (B) on the yield of PS

2.8 两相体积比、底物质量比、温度和pH对PS产率的影响

当卵磷脂与L-丝氨酸的质量为1∶8、反应温度为35 ℃、pH为6.00、固定化PLD的加入量为35%时,研究两相体积比对PS产率的影响。结果如图8A所示,随着有机相的增加,PS产率逐渐增大,当有机相与水相的比例为8∶1时,PS的产率达到最大值(83.40%±1.60%),而当有机相与水相的比例从6∶1增加到8∶1时,PS产率增加很小。综合考虑PS转化率和成本,选取有机相与水相的体积比为6∶1作为该合成体系的最佳体积比。当有机相与水相的比为6∶1、反应温度为35 ℃、pH为6.00、固定化磷脂酶D的加入量为35%时,研究底物质量比对PS产率的影响。试验结果如图8B所示,当磷脂酰胆碱与L-丝氨酸的比例为1∶10时,PS的产率达到最大值(83.70%±1.80%),在卵磷脂与L-丝氨酸的比例为1∶8和1∶10时,PS的产率相接近。综合考虑生产成本的因素,选取卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8是较为合理的比例。在有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、pH为6.00、固定化PLD的加入量为35%时,研究温度对PS产率的影响。试验结果如图8C所示,在温度为40 ℃时,PS产率达到最大值(84.10%±1.70%)。在有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、反应温度为40 ℃、固定化PLD的加入量为35%时,研究pH对PS产率的影响。试验结果如图8D所示,在pH为6.50时,PS产率达到最大值(85.10%±1.60%)。综上可知,合成PS的pH为6.50,温度为40 ℃比较适宜。

图8 两相体积比(A)、底物质量比(B)、温度(C)和pH(D)对PS产率的影响Fig.8 Effects of two phase volume ratio (A), molar ratio of substrate (B), temperature (C) and pH (D) on PS yield

2.9 固定化PLD的加入量和循环使用次数对PS产率的影响

当有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8、反应温度为40 ℃、pH为6.50时,研究了固定化PLD的加入量对PS产率的影响。结果如图9A所示:随着加酶量的增加,PS的产率先快速上升后趋于平缓的状态。当加酶量为40%时,PS的产率达到最大值(86.60%±1.40%),在最佳条件下测得副产物胆碱的含量为6.30%±1.70%、PS的纯度为90.30%。因此,综合考虑磷脂酰丝氨酸的转化率,选取固定化PLD的加入量为40%时为最佳。酶的可重复使用性不仅可以影响经济效益,也是实现工业化的重要前提[28]。对固定化PLD和游离PLD的催化性能进行比较和研究,结果如图9B所示,介孔二氧化硅固定化PLD重复使用7次,PS的产率依然有61.30%±1.60%,而游离PLD重复使用4次,PS的产率只有21.60%±1.80%。综上所述,固定化PLD在制备PS时具有纯度高、催化性能好,可实现酶的多次重复使用的优点。

图9 固定化PLD的加入量(A)和循环使用次数(B)对PS产率的影响Fig.9 Effects of addition volume (A) and recycling number (B) of immobilized PLD addition volume on PS yield

3 结论与讨论

本研究利用大豆PLD的转磷脂酰化反应在水-有机界面,以大豆卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物合成PS。但游离PLD在高温、极端的pH及有机溶剂中不稳定,容易发生变性,造成酶活性的降低;此外,游离PLD难以回收再利用,会增加PS的生产成本。

本研究制备的介孔二氧化硅的BET比表面积为948 m2/g、气孔体积为1.35 cm3/g,孔径大小与磷脂酶D相接近,为8.20 nm,平均粒径为335.10 nm,且形貌为近球形结构,因此,选用介孔二氧化硅作为固定化PLD的载体。当温度为35 ℃、pH为6.50、物理吸附时间为2 h、酶液加入体积为1.00 mL、交联时间为1.50 h、乙醇加入体积为5.00 mL、戊二醛加入体积为0.40 mL时,固定化PLD的相对酶活性达到最大值(88.89%±1.00%),蛋白固定化率为80.76%±1.30%。使用制得的介孔二氧化硅固定PLD催化合成PS的最佳工艺条件:有机相与水相的比为6∶1、卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8,反应温度为40 ℃,pH为6.50、加酶量为40.00%,此条件下PS的产率为86.60%±1.40%,HPLC测定PS的纯度为90.30%。

70 ℃时游离PLD的相对酶活只剩余15.3%,而固定化PLD的相对酶活性仍然有66.4%;贮存50%时游离PLD的相对酶活性只剩余11.2%,而固定化PLD的相对酶活性依然有50.1%。游离PLD被固定化后酶的半衰期由20 d延长到50 d。固定化PLD循环使用7次,PS的产率依然有61.70%±1.60%;游离PLD循环使用4次,PS的产率只有21.60%±1.80%。综上可知,介孔二氧化硅作为固定化酶的载体时,PLD分子通过交联作用可以形成坚固的酶网覆盖在介孔二氧化硅表面上,使PLD的热稳定性、贮存稳定性、对pH的耐受性以及催化性能均得到明显的提升,并实现了PLD的多次回收重复使用。

本研究以高纯度的大豆卵磷脂作为反应底物,利用PLD的转磷脂酰化反应合成大豆PS。生物酶法制备的PS的产品纯度较高,具有一定的工业化应用前景。李冰麟[1]选用纳米二氧化硅作为固定化PLD的载体,通过吸附-沉淀-交联固定化PLD,酶蛋白的固定化速率可高达80%;而本研究使用制备的介孔二氧化硅固定的PLD蛋白固定化率为80.76%±1.30%,表明本研究制备的介孔二氧化硅是较为理想的固定PLD材料。Zhang等[29]将PLD固定在用十八烷基三甲氧基硅烷修饰的有序介孔硅立方体(OMSC)中,固定后的PLD在40 ℃下相对酶活性为90%以上,固定化后,PLD的半衰期从25 d延长到40 d;本研究中使用制备的介孔二氧化硅固定的PLD在40 ℃下相对酶活性在91%以上,在70 ℃下相对酶活性仍然有66.4%,且游离PLD被固定化后酶的半衰期由20 d延长到50 d,表明使用本研究制备的介孔二氧化硅固定PLD可以显著提高PLD的热稳定性、贮存稳定性、对pH的耐受性以及催化性能。但本研究在酶催化制备PS时虽然选用了毒性比乙醚小的乙酸乙酯作为有机相,但是还具有一定的毒性,后续可以考虑其他绿色试剂替代乙酸乙酯有机溶剂。本研究只选用了纳米级介孔二氧化硅作为固定化PLD的载体,固定化后的酶活性和固定化速率较为理想,后续还可考虑将介孔二氧化硅用其他官能团修饰作为固定化酶的载体制备固定化印迹PLD,尽可能使固定化的PLD的酶活性大于初始酶活性,加快PLD的催化性能,降低生产成本,提高成品的纯度。本研究以卵磷脂和L-丝氨酸作为反应底物,利用PLD的转磷脂酰化反应在乙酸乙酯-水反应体系合成PS只是一个初步的探究,后续可以通过设计流化床式反应器,对该反应连续生产PS进行放大试验。