紫草素调节Nrf2/HO-1 信号通路对实验性大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎的治疗作用研究

李凡凡, 徐阳, 王晓旭

1.天津中医药大学第一附属医院（国家中医针灸临床医学研究中心）乳腺外科，天津300193； 2.天津中医药大学第一附属医院（国家中医针灸临床医学研究中心）疮疡血管外科，天津 300193

肉芽肿性小叶性乳腺炎（GLM）是一种罕见的乳腺特发性慢性炎症性病变，在临床和乳房X 光检查中通常伪装成乳腺癌[1]。GLM 的病因和发病机制目前尚不清楚，其诊断治疗是一个挑战。 紫草素（Shikonin, SHI）是从紫草根中分离出来的一种天然萘醌类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种活性[2]。研究表明紫草素能通过抑制NF-κB 信号通路在LPS 诱导的乳腺炎中发挥抗炎作用[3]。Nrf2/HO-1信号通路是氧化应激反应中不可或缺的信号通路，参与抗炎、抗氧化、细胞凋亡等过程[4]。Nrf2 是一种关键的转录因子，调节细胞的氧化应激，也是维持细胞内氧化还原稳态的重要调节因子[5]。热休克蛋白家族成员HO-1 是一种重要的抗炎、抗氧化和细胞保护酶，受主要转录因子Nrf2 激活的调节，HO-1 表达上调对氧化应激和炎症条件下的细胞起保护作用。研究表明犬尿烯酸能通过抑制NF-κB 和激活Nrf2/Ho-1，减少炎症反应和增强血乳屏障完整性来减轻LPS 诱导的乳腺炎[6]。紫草素能否通过调节Nrf2/HO-1 信号通路改善大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎尚不清楚，本文建立肉芽肿性小叶性乳腺炎大鼠模型，基于Nrf2/HO-1 信号通路，探讨紫草素对肉芽肿性小叶性乳腺炎的治疗作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级大鼠，180～220 g，购自广东南模生物科技有 限 公 司（SCXK（粤）2022-0062）；紫 草 素（HYN0822）和ML385（HY-100523）均购自MCE 公司；IL-1β（SP12225）、TNF-α（SP12250）、IL-8（SP12278）、SOD（SP12914）和GSH（SP12673）ELISA 试剂盒均购自武汉赛培生物科技有限公司；T-AOC（CB11081-Ra）和MPO（CB10780-Ra）ELISA 试剂盒均购自上海科艾博生物技术有限公司；NAGase（ER1177）ELISA 试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司；ROS（JN482）ELISA 试剂盒购自上海纪宁生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq 试剂盒（RR390Q）购自Takara Bio 公司；抗体HO-1（ab305290）、GAPDH（ab8245）和二抗山羊抗兔IgG（ab6721）均购自Abcam 公司；抗体Nrf2（AF7623）和NLRP3（AF2155）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 肉芽肿性小叶性乳腺炎大鼠模型建立

根据参考文献[7]建立肉芽肿性小叶性乳腺炎（GLM）大鼠模型。将人新鲜GLM 病变组织制成病变乳腺组织匀浆液，取0.04 mL 病变乳腺组织匀浆液在大鼠第3、4 对乳房进行注射包埋。正常大鼠注射等量的生理盐水。1 周后进行大鼠乳腺组织局部观察，随后处死2 只大鼠，取第3、4 对乳腺组织进行病例切片观察，镜下出现特征性脂质空泡周围伴多种炎症细胞浸润，形成肉芽肿性炎症或微脓肿时即可确认造模成功。将GLM 大鼠分为模型组（GLM 组）、紫草素低剂量组（SHI-L 组）、紫草素中剂量组（SHI-M组）、紫草素高剂量组（SHI-H 组）和紫草素高剂量+Nrf2 抑制剂ML385 组（SHI-H+ML385 组），每组15只。另取15 只正常大鼠作为对照组（Control 组）。根据参考文献[3]及药物剂量调整，SHI-L 组、SHI-M 组和SHI-H 组大鼠分别灌胃17.5、35、70 mg·kg-1·d-1的紫草素。SHI-H+ML385 组灌胃70 mg·kg-1·d-1的紫草素+腹 腔 注 射14 mg·kg-1·d-1的ML385[8]。Control 组 和GLM 组给予等量的生理盐水。连续干预14 d。

1.2.1 HE 染色观察乳腺组织病理学变化 各组随机取5 只大鼠，取出乳腺组织，浸泡于4%多聚甲醛中固定，然后进行石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下观察组织病理变化。

1.2.2 炎症因子水平和氧化指标检测 各组随机取5只大鼠，取出乳腺组织进行匀浆，离心收集上清液，按照ELISA 试剂盒说明操作检测乳腺组织中炎症因子IL-1β、TNF-α 和IL-8 水 平 及 过 氧 化 指 标T-AOC、SOD、GSH 和ROS 水平。

1.2.3 MPO 和NAGase 水平检测 使用1.2.2 中乳腺组织匀浆，离心获得上清液，严格按照ELISA 检测试剂盒说明书操作，检测MPO 和NAGase 水平。

1.2.4 NLRP3 炎性小体表达检测 使用1.2.1 中的各组大鼠乳腺组织石蜡切片，脱水并水合，3%过氧化氢酶处理切片阻断内源性过氧化物酶活性，与抗体NLRP3 在4 ℃下孵育过夜，后与荧光二抗室温孵育1h，DAPI 复染，共聚焦显微镜下拍照观察，并计算NLRP3 阳性率，NLRP3 阳性率（%）=NLRP3 阳性细胞数/DAPI×100%。

1.2.5 Nrf2、HO-1 蛋白水平检测 将各组剩余5 只大鼠处死，取出乳腺组织。RIPA 缓冲液裂解各组大鼠乳腺组织，提取蛋白，BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，样品经SDS-PAGE 分离，转移到PVDF 膜上，后使用5%的脱脂奶粉封闭1 h，与一抗Nrf2、HO-1 和GAPDH 在4 ℃下过夜孵育。后与二抗山羊抗兔IgG室温孵育2h，ECL 显影，Image J 软件计算蛋白灰度值。

1.3 数据分析

所有实验数据采用SPSS 20.0 进行统计分析，实验数据符合正态分布以(均值±标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织病理变化的影响

与Control 组相比，GLM 组大鼠乳腺小叶被破坏、大片结节样慢性肉芽肿炎性病灶生成，乳腺小叶组织边界不清，腺叶内出现空泡，伴有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润；与GLM 组相比，SHI-L 组、SHI-M 组和SHI-H 组乳腺组织病变逐渐减轻；与SHI-H 组相比，SHI-H+ML385 组乳腺组织病变加重(图1)。

图1 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织病理变化的影响A: Control 组B: GLM 组C: SHI-L 组D: SHI-M 组E: SHI-H 组F: SHI-H+ML385 组Fig. 1 Effect of shikonin on pathological changes of mammary gland tissue in GLM rats. A: Control group; B:GLM group; C: SHI-L group; D: SHI-M group; E: SHI-H group; F: SHI-H+ML385 group.

2.2 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织炎症因子水平和氧化指标的影响

与Control 组相比，GLM 组大鼠乳腺组织IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水 平 显 著 增 加（P＜0.05），TAOC、SOD 和GSH 水平显著降低（P＜0.05）；与GLM组相比，SHI-L 组、SHI-M 组和SHI-H 组大鼠乳腺组织IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水平依次降低（P＜0.05），TAOC、SOD 和GSH 水平依次增加（P＜0.05）；与SHI-H组相比，SHI-H+ML385 组大鼠乳腺组织IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水平显著增加（P＜0.05），T-AOC、SOD和GSH 水平显著降低（P＜0.05），见表1 和表2。

表1 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织炎症因子水平的影响（±s, n=5）Tab.1 Effect of shikonin on the levels of inflammatory factors in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, n=5)

表1 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织炎症因子水平的影响（±s, n=5）Tab.1 Effect of shikonin on the levels of inflammatory factors in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 组; bP＜0.05 vs GLM 组; cP＜0.05 vs SHI-L 组;dP＜0.05 vs SHI-M 组; eP＜0.05 vs SHI-H 组。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

TNF-α（pg/mL）76.47±5.32 226.82±13.17a 164.63±10.09b 138.25±8.42bc 89.68±5.91bcd 115.11±6.24e 203.352＜0.001 Groups Control 组GLM 组SHI-L 组SHI-M 组SHI-H 组SHI-H+ML385 组FP IL-8（ng/L）1.53±0.04 2.96±0.12a 2.61±0.10b 1.95±0.09bc 1.64±0.07bcd 1.79±0.05e 238.901＜0.001 IL-1β（pg/mL）5.02±0.24 18.43±2.05a 14.61±0.86b 9.57±0.35bc 5.34±0.41bcd 7.25±0.58e 156.297＜0.001

表2 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织氧化指标的影响（±s ,U/mg, n=5）Tab.2 Effect of shikonin on oxidative indicators of mammary tissue in GLM rats (Mean±SD,U/mg, n=5)

表2 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织氧化指标的影响（±s ,U/mg, n=5）Tab.2 Effect of shikonin on oxidative indicators of mammary tissue in GLM rats (Mean±SD,U/mg, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 组；bP＜0.05 vs GLM 组；cP＜0.05 vs SHI-L 组；dP＜0.05 vs SHI-M 组；eP＜0.05 vs SHI-H 组。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

ROS Groups T-AOC SOD GSH 1.14±0.07 5.82±0.47a 4.75±0.36b 3.28±0.21bc 1.86±0.09bcd 2.39±0.18e 217.750＜0.001 Control 组GLM 组SHI-L 组SHI-M 组SHI-H 组SHI-H+ML385 组FP 64.79±4.10 21.68±1.06a 33.04±1.15b 45.47±1.41bc 58.03±2.79bcd 51.25±2.36e 222.767＜0.001 174.32±10.56 76.82±4.32a 94.63±5.85b 128.25±6.91bc 159.68±9.03bcd 132.11±7.76e 116.951＜0.001 264.06±18.26 104.58±8.79a 145.61±12.43b 193.85±11.37bc 251.69±15.48bcd 206.92±13.01e 101.905＜0.001

2.3 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平的影响

与Control 组相比，GLM 组大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平显著增加（P＜0.05）；与GLM 组相比，SHI-L 组、SHI-M 组和SHI-H 组大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平依次降低（P＜0.05）；与SHI-H 组相比，SHI-H+ML385 组大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平显著增加（P＜0.05），见表3。

表3 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平的影响（±s, ng/mL, n=5）Tab. 3 Effect of shikonin on MPO and NAGas levels in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, ng/mL, n=5)

表3 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织MPO 和NAGase 水平的影响（±s, ng/mL, n=5）Tab. 3 Effect of shikonin on MPO and NAGas levels in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, ng/mL, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 组；bP＜0.05 vs GLM 组；cP＜0.05 vs SHI-L 组；dP＜0.05 vs SHI-M 组；eP＜0.05 vs SHI-H 组。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

NAGase MPO 27.83±1.64 64.12±4.07a 56.37±3.29b 43.06±2.81bc 32.84±2.25bcd 38.10±2.43e 120.028＜0.001 Control 组GLM 组SHI-L 组SHI-M 组SHI-H 组SHI-H+ML385 组FP 34.53±2.84 92.96±7.73a 78.61±5.42b 65.95±4.17bc 43.64±2.36bcd 51.95±3.21e 110.016＜0.001

2.4 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达的影响

与Control 组相比，GLM 组大鼠乳腺组织NLRP3阳性表达率显著增加（P＜0.05）；与GLM 组相比，SHIL 组、SHI-M 组和SHI-H 组大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达率依次降低（P＜0.05）；与SHI-H 组相比，SHI-H+ML385 组大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达率显著增加（P＜0.05），见图2 和表4。

表4 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达的影响（±s ,%, n=5）Tab.4 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, %, n=5)

表4 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达的影响（±s ,%, n=5）Tab.4 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, %, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 组；bP＜0.05 vs GLM 组；cP＜0.05 vs SHI-L 组；dP＜0.05 vs SHI-M 组；eP＜0.05 vs SHI-H 组。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

NLRP3 阳性表达率NLRP3 positive expression rate 7.89±0.35 45.36±3.62a 40.12±3.01b 24.79±2.17bc 14.63±1.86bcd 20.44±2.05e 183.946＜0.001组别Groups Control 组GLM 组SHI-L 组SHI-M 组SHI-H 组SHI-H+ML385 组FP

图2 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织NLRP3 阳性表达的影响(标尺50 μm)Fig.2 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats.(bar=50 μm)

2.5 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响

与Control 组相比，GLM 组大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与GLM 组相比，SHI-L 组、SHI-M 组 和SHI-H 组 大 鼠 乳 腺 组 织Nrf2 和HO-1 蛋白表达依次增加（P＜0.05）；与SHI-H 组相比，SHI-H+ML385 组大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图3 和表5。

表5 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响（±s , n=5）Tab.5 Effect of shikonin on Nrf2 and HO-1 protein expression in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, n=5)

表5 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响（±s , n=5）Tab.5 Effect of shikonin on Nrf2 and HO-1 protein expression in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 组；bP＜0.05 vs GLM 组；cP＜0.05 vs SHI-L 组；dP＜0.05 vs SHI-M 组；eP＜0.05 vs SHI-H 组。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

HO-1 0.74±0.04 0.13±0.01a 0.30±0.02b 0.48±0.03bc 0.69±0.05bcd 0.53±0.06e 177.418＜0.001 Groups Control 组GLM 组SHI-L 组SHI-M 组SHI-H 组SHI-H+ML385 组FP Nrf2 0.94±0.07 0.32±0.02a 0.51±0.03b 0.76±0.06bc 0.91±0.04bcd 0.80±0.05e 127.568＜0.001

图3 紫草素对GLM 大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响A: Control 组 B: GLM 组 C: SHI-L 组 D: SHI-M 组 E: SHI-H 组F: SHI-H+ML385 组Fig.3 Effect of shikonin on the expression of Nrf2 and HO-1 proteins in breast tissue of GLM rats. A: Control group；B:GLM group； C: SHI-L group； D: SHI-M group； E: SHI-H group；F: SHI-H+ML385 group.

3 讨论

GLM 是一种罕见的慢性乳腺良性炎症性疾病，通常表现为非干酪样肉芽肿性病变。在过去二十年里，随着发病率的迅速增加，GLM 往往发生在育龄妇女身上，病程长且反复发作[9]。研究表明紫草素主要通过调节多种信号通路、NLRP3 炎性体、活性氧应激、Bax/Bcl-2 等发挥抗炎、抗癌、心血管保护等作用[10]。紫草素是一种很有前途的药物，有必要对紫草素进行广泛和深入的探索，以加快紫草素类药物在临床中的应用。Lebda[11]等研究表明纳米姜黄素显著降低MDA、氧化型谷胱甘肽、促炎细胞因子的释放以及TLR4、NF-κB p65 和HMGB1 的基因表达，提高还原型谷胱甘肽水平和Nrf2 活性，减轻LPS 诱导的乳腺炎的炎症和氧化应激。本研究中紫草素治疗后大鼠乳腺组织病变减轻，乳腺组织IL-8、IL-1β 和TNF-α 水平降低，T-AOC、SOD 和GSH 水平增加。表明紫草素能抑制炎症因子及氧化应激水平，发挥抗炎和抗氧化作用，改善大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎。

在炎症部位中性粒细胞迅速集结，识别、吞噬和灭活外来微生物[12]。MPO 是中性粒细胞的主要成分，MPO 的激活可被视为中性粒细胞浸润的直接生物标志物，外部刺激可导致中性粒细胞聚集，MPO 产生增加[13]。研究表明鸡骨草总黄酮可以降低乳腺炎小鼠乳腺组织中的MPO 活性，减少中性粒细胞的聚集，缓解LPS 诱导的小鼠乳腺炎症[14]。NAGase 主要来源于乳腺上皮细胞，乳腺组织中NAGase 的水平与乳腺炎的严重程度成正比，当乳腺上皮细胞被破坏时释放NAGase，该因素是乳腺上皮细胞损伤程度的标志[15]。研究显示抑制MPO 和NAGase 活性，减少炎症细胞浸润，能保护大鼠乳腺组织免受过度炎症反应的损伤[16]。NLRP3 炎性小体在乳腺炎等炎症性疾病的发病机制中起重要作用，通常被ATP 和活性氧（ROS）等各种“危险信号”激活[17]。NLRP3 炎症小体通过调节炎症因子水平影响炎症的后续发展[18]。持续和不受控制的炎症与氧化应激密切相关，严重的炎症反应导致更多的ROS 产生，过量的ROS 会引起更严重的炎症，加剧组织破坏[19]。本研究中紫草素治疗后大鼠乳腺组织MPO、NAGase、ROS 水平及NLRP3 表达降低。表明紫草素能通过降低MPO、NAGase、ROS 水平减少炎症细胞浸润，抑制氧化应激反应，缓解炎症。Nrf2/HO-1 信号通路被认为是最关键的内源性抗氧化应激途径之一，是炎症相关疾病的重要靶标[20]。转录因子Nrf2 是抗氧化系统的主要调节因子，HO-1 被认为是一种细胞保护、抗炎和抗氧化酶，Nrf2 和HO-1 是抗氧化信号传导的重要调节剂[21]。研究表明转录因子Nrf2 通过诱导HO-1 来减轻炎症，对氧化应激起到保护作用[22]。Nrf2 储存在细胞质中，在正常状态下与Keap 1 结合。当受到氧化刺激时，Nrf2 从细胞质转移到细胞核，然后诱导HO‐1 转录并发挥抗氧化作用[23]。Zhao[24]等研究表明衣康酸二甲酯上调Nrf2、HO-1、p38 和ERK 的 磷 酸 化，下 调TLR4 和p65-NF-κB 的 磷酸化，降低乳腺的病理损伤及炎症因子水平，改善LPS 诱导的乳腺炎。本研究中紫草素治疗后大鼠乳腺组织Nrf2 和HO-1 蛋白下调，炎症因子水平降低及氧化应激反应受到抑制，抑制剂ML385 逆转了紫草素对肉芽肿性小叶性乳腺炎大鼠的抗炎及抗氧化作用。表明紫草素可能通过激活Nrf2，上调HO-1 表达，进而抑制大鼠炎症反应及氧化应激，缓解大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎。

综上所述，紫草素可能通过增强Nrf2 和HO-1 的表达，抑制炎症因子水平，增强抗氧化能力，发挥抗炎和抗氧化作用，改善大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎。紫草素对肉芽肿性小叶性乳腺炎大鼠的治疗作用可能是通过激活Nrf2/HO-1 信号通路实现的。