依达拉奉经MAPKs 通路对脂多糖激活的小胶质细胞Sirt3 表达调控

祁志， 杨力， 贾秋叶， 陈浩伦， 段兆达， 吴春云*

昆明医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，昆明 650500

中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎症是感染性、自身免疫性、创伤性、脱髓鞘和神经退行性疾病等神经系统疾病的重要特征[1]。作为CNS 的免疫细胞，小胶质细胞激活介导的神经炎症可加剧神经组织损伤或坏死，造成不可逆的病变[2]。因此，调控小胶质细胞的激活状态有望成为治疗神经炎性疾病的新方法。依达拉奉（Edaravone）是近年用于治疗脑卒中、创伤性脑损伤等疾病的药物，主要有清除自由基、抑制炎症反应和调控细胞凋亡等作用。课题组前期研究表明，依达拉奉能抑制小胶质细胞激活、减轻脑水肿和降低脑梗死体积，对脑缺血发挥较好的神经保护作用[3]。但依达拉奉调节小胶质细胞的分子机制尚未阐明。丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38 MAPK，它们对细胞增殖、凋亡及炎症等过程有重要调节作用。课题组前期发现，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活的BV2细胞和大鼠脑缺血模型中，灯盏乙素可通过小胶质细胞MAPKs 信号通路发挥抗炎作用[4]。沉默信息调节因子3（Sirtuin3，Sirt3）是一种脱乙酰化酶，在炎症和凋亡中起关键作用，小胶质细胞中Sirt3 过表达可减少炎症因子产生[5]。由于MAPKs 信号与Sirt3 变化相关，提示依达拉奉的抗炎作用可能经调控小胶质细胞中MAPKs 和Sirt3 信号而实现。本研究采用LPS 制备激活的BV2 小胶质细胞，经依达拉奉和ERK1/2 抑制剂处理，检测MAPKs 信号通路相关因子和Sirt3 的变化，探究依达拉奉调控小胶质细胞发挥神经保护作用的可能机制，为推进依达拉奉的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 BV2 小胶质细胞，由新加坡国立大学林荣安教授惠赠。

1.1.2 主要材料和仪器 依达拉奉注射液（吉林博大制药，10 mL：15 mg）；ERK1/2 抑制剂（SCH772984）购自Selleck 公司；兔抗Sirt3 抗体购自Santa-Cruz 公司，兔抗P38 和兔抗p-P38 抗体购自CST 公司，兔抗JNK、兔抗p-JNK、兔抗ERK1/2 和兔抗p-ERK1/2 抗体购自Abcam 公司；小鼠抗β-actin 抗体、HRP 标记山羊抗小鼠Ig G 和山羊抗兔Ig G 购自Protein-tech 公司；Cy3 标记的山羊抗兔荧光二抗、含DAPI 的荧光封片剂和FITC 标记的lectin（小胶质细胞标记物）购自Sigma 公司。Western blot 电泳设备、凝胶成像分析系统、凝胶成像仪购自Bio-Rad 公司；倒置荧光显微镜（Axio Observer Z1）购自ZEISS 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 BV2 小胶质细胞株复苏后，置于5% CO2，37 ℃无菌培养箱中培养。细胞密度长到约80%时进行传代；传3 代后进行后续实验。

1.2.2 制备及分组处理激活的BV2 细胞 细胞随机分为对照组（Con）、LPS 激活组（LPS）和LPS+依达拉奉组（LPS+E）（n=4），6 孔板培养BV2 细胞到细胞密度约80% 时弃培养基，用PBS 清洗后加入无血清DMEM 高糖培养基（BM），并在LPS+E 组使用依达拉奉（100 μmol/L）预处理1 h 后更换BM，分别在LPS 组及LPS+E 组加入LPS（1 μg/mL）处理3 h[6]。

抑制剂实验分为对照组（Con）、抑制剂组（I）、LPS 激活组（LPS）、LPS+抑制剂组（LPS+I）、LPS+依达拉奉组（LPS+E）以及LPS+抑制剂+依达拉奉组（LPS+E+I），细胞密度约80%时弃培养基并用PBS 清洗后加入培养基，I 组、LPS+I 组和LPS+E+I 组加入浓度为4 nM 的ERK1/2 抑制剂（SCH772984）孵育1 h（浓度参照说明书），随后用依达拉奉（100 μmol/L）处理LPS+E 组和LPS+E+I 组1 h，最后用LPS（1 μg/mL）处理LPS 组、LPS+I 组、LPS+E 组和LPS+E+I 组3 h。上述实验参考课题组前期研究[3]。

1.2.3 Western blot 检测 细胞完成药物处理后，每孔注入60 μL 预制裂解液（RIPA：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1）提取总蛋白；高温加热（95 ℃，5 min）使蛋白充分变性。按照实验分组进行电泳、转膜，时间据分子量大小而定；转膜结束后封闭，清洗后分别加入兔抗Sirt3 抗体（1：2000）、兔抗P38 抗体（1：5000）、兔抗p-P38 抗体（1：2500），兔抗JNK 抗体（1：5000）、兔抗p-JNK 抗 体（1：5000）、兔 抗ERK1/2 抗 体（1：5000）)、兔抗p-ERK1/2 抗体（1：5000）和小鼠抗β-actin抗体（1：5000），阴性对照采用溶剂PBS 替换二抗；放置于4 ℃冰箱中摇床过夜。次日回收一抗，清洗后加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（1：5000）、HRP 标记的山羊抗鼠二抗（1：5000），阴性对照采用溶剂PBS 替换二抗。常温孵育后显影并存储。每组独立重复实验3 次。

1.2.4 免疫荧光双标染色 用24 孔板培养细胞，生长密度约80%时给药，LPS 和依达拉奉浓度不变，其余步骤同前。各组细胞制备结束后每孔加入4%多聚甲醛300 μL 固定，10%山羊血清封闭；分别滴加一抗兔抗Sirt 3 抗体（1：200）、兔抗P38 抗体（1：400）、兔抗p-P38 抗体（1：200），兔抗JNK 抗体（1：200）、兔抗p-JNK 抗体（1：200）、兔抗ERK1/2 抗体（1：200）、兔抗p-ERK1/2 抗体（1：200），阴性对照组以PBS 代替一抗，4 ℃孵育过夜，分别滴加二抗：Cy3 标记的山羊抗兔IgG（1：200）和FITC 标记的lectin（1：200），阴性对照采用PBS 替换二抗，室温避光孵育1 h。用含DAPI 的荧光封片剂封片，荧光显微镜进行观察和拍照。每组独立重复实验3 次。

1.3 统计学分析

用统计学软件GraphPad Prism 8.0.2 进行单因素方差分析（one-way ANOVA），再进行两样本间t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 依达拉奉促进BV2 细胞Sirt3 与p-ERK1/2 表达

Western blot 结 果 显 示：LPS 激 活 后Sirt3 与p-ERK1/2 在BV2 细胞中的表达明显增高（P＜0.05）；依达拉奉组Sirt3 与p-ERK1/2 的表达显著增强（P＜0.01）。免疫荧光染色结果显示：各组lectin 阳性细胞中，LPS 组的Sirt3 与p-ERK1/2 表达明显增高，依达拉奉处理后Sirt3 与p-ERK1/2 表达进一步增高，与LPS组相比具有统计学差异（P＜0.01）。提示依达拉奉可促进BV2 细胞中Sirt3 与p-ERK1/2 表达，见图1～4。

图1 依达拉奉对BV2 细胞Sirt3 蛋白表达作用A：Western blot 条带 B：各组Sirt3 表达量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.1 Effect of edaravone on the Sirt3 protein expression in BV2 cells.A: Western Blot bands; B: Quantitative analysis of Sirt3 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

图2 免疫荧光双标染色检测BV2 小胶质细胞Sirt3 表达A：免疫荧光双标染色图（标尺=20 μm）B：各组Sirt3 表达量化分析（n=4）** P＜0.01Fig. 2 Immunofluorescence result showed the Sirt3 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining ( Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of Sirt3 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

图3 依达拉奉对BV2 细胞p-ERK1/2 和ERK1/2 蛋白表达作用A：Western blot 条带 B：各组p-ERK1/2 和ERK1/2 表 达 量 化分析（n=4）) ** P＜0.01Fig.3 Effect of edaravone on the p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expression in BV2 cells. A: Western Blot bands；B: Quantitative analysis of p-ERK1/2 and ERK1/2 expression levels in each group (n=4); **P＜0.01.

图4 免疫荧光双标染色检测BV2 小胶质细胞p-ERK1/2 表达A：免疫荧光双标染色图（标尺=20 μm）B：各组p-ERK1/2 表达量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.4 Immunofluorescence result showed the p-ERK1/2 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-ERK1/2 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

2.2 依达拉奉抑制BV2 细胞中p-P38 与p-JNK 表达

Western blot 结 果 显 示：LPS 激 活 后p-P38 与p-JNK 在BV2 细胞中表达增高（P＜0.05），依达拉奉组较LPS 组的表达明显下降（P＜0.05）。免疫荧光染色结果显示：各组lectin 阳性细胞中，LPS 组p-P38 与p-JNK表达增高（P＜0.01）；依达拉奉预处理后p-P38 与p-JNK 表达明显降低（P＜0.01）。提示依达拉奉可抑制激活的BV2 细胞表达p-ERK1/2 与p-JNK，见图5～8。

图5 依达拉奉对BV2 细胞中p-P38 和P38 蛋白表达作用A：Western blot 条带B：各组p-P38 和P38 表达量化分析（n=4）* P＜0.05，** P＜0.01Fig.5 Effect of edaravone on the p-P38 and P38 protein expression in BV2 cells.A:Western Blot bands;B: Quantitative analysis of p-P38 and P38 expression levels in each group (n=4); * P＜0.05, ** P＜0.01.

图6 免疫荧光双标染色检测BV2 小胶质细胞p-P38 表达A：免疫荧光双标染色图（标尺=20 μm）B：各组p-P38 表达量化分析（n=4）*P＜0.05，**P＜0.01Fig. 6 Immunofluorescence showed the p-P38 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-P38 expression levels in each group(n=4); * P＜0.05, ** P＜0.01.

图7 依达拉奉对BV2 细胞中p-JNK 和JNK 蛋白表达作用A：Western blot 条带B：各组p-JNK 和JNK 表达量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.7 Effect of edaravone on the p-JNK and JNK protein expression in BV2 cells. A: Western Blot bands; B: Quantitative analysis of p-JNK and JNK expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

图8 免疫荧光双标染色检测BV2 小胶质细胞p-JNK 表达A：免疫荧光双标染色图（标尺=20 μm）B：各组p-JNK 表达量化分析（n=4）* P＜0.05Fig. 8 Immunofluorescence showed the p-JNK expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-JNK expression levels in each group(n=4); * P＜0.05.

图 9 依达拉奉对ERK1/2 抑 制 后BV2 细胞中p-ERK1/2 和Sirt3作用A：Western blot 条带 B：各组p-ERK1/2 和Sirt3 表 达量化分析（n=4）加抑制剂组 别 分 别 为I、LPS+I、LPS+E+I ** P＜0.01Fig. 9 Effect of edaravone on the p-ERK1/2 and Sirt3 expression in BV2 cells after ERK1/2 inhibition.A: Western Blot bands; B:Quantitative analysis of p-ERK1/2 and Sirt3 expression levels in each group (n=4); the inhibitor groups were respectively indicated as I, LPS+I, LPS+E+I; ** P＜0.01.

2.3 抑制ERK1/2 可下调BV2 细胞中Sirt 3 和p-ERK1/2 表达

Western blot 结果显示：使用依达拉奉预处理LPS激活的小胶质细胞后p-ERK1/2 和Sirt3 表达明显升高，与LPS 激活组比较有显著性差异（P＜0.05）；ERK1/2 被抑制后，p-ERK1/2 和Sirt3 表达降低（P＜0.05），再给予依达拉奉未能明显升高p-ERK1/2 和Sirt3 的表达（图9）。表明依达拉奉对Sirt3 的调节可能经ERK1/2途径实现。

3 讨论

人和动物发生CNS 疾病时，小胶质细胞被激活并释放致炎因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮（NO）、白介素1-β（IL-1β）等[7]，引发神经炎症和神经元死亡。探明小胶质细胞介导神经炎症的机制并适当干预是防治CNS 疾病的新方向。课题组前期对大鼠脑缺血的研究发现，依达拉奉能明显抑制脑内激活的小胶质细胞，降低TNFα、NO 及IL-1β 表达，发挥良好的抗炎作用[3]；同时体外实验观察到依达拉奉能降低激活的BV2 小胶质细胞中多个炎症因子的表达。有学者在体外实验中发现，依达拉奉可以调节BV2 细胞的激活程度，显著降低NO 和TNF-α 的表达[7]，与本课题组研究相一致。但这些研究并未阐明依达拉奉的抗炎机制。

MAPKs 通路被抑制时可降低小胶质细胞产生多种炎症因子，改善大脑功能[8,9]。本研究发现：依达拉奉能有效调节BV2 细胞中p-ERK1/2、p-P38 和p-JNK的表达，可能经MAPKs 通路发挥抗炎作用。有学者认为依达拉奉可经TLR4/NF-κB/TNF-α 通路减轻小鼠脑缺血再灌注损伤[10]。Yin 等[11]发现在缺氧缺血性脑损伤时，Sirt3 具有抗氧化应激和抗炎的作用；脑缺血或氧糖剥夺的神经元中，随Sirt3 上调神经炎症得以减轻[12]。本研究也观察到，依达拉奉能促进小胶质细胞表达p-ERK1/2，促进Sirt3 蛋白水平升高，当ERK1/2 被抑制后p-ERK1/2 和Sirt3 的表达均下降，说明Sirt3不仅调节炎症反应，还与MAPKs 信号变化密切相关。有研究发现大鼠肾缺血再灌注后，上调的p-ERK1/2可促进Sirt3 恢复[13]；破骨细胞中Sir3 被抑制时，p-ERK 和p-JNK 的表达降低[14]。这些研究均提示MAPKs 通路参与调节Sir3 表达，从而发挥保护作用。由于ERK1/2 是MAPKs 通路中的关键因子，依达拉奉可能经ERK1/2 调控MAPKs 通路进而增加Sirt3 的表达，对激活的小胶质细胞发挥抗炎作用。对于依达拉奉调节小胶质细胞的确切机制需进一步探究。

综合课题组研究结果表明，依达拉奉可调控小胶质细胞中ERK1/2、P38 和JNK 的磷酸化水平，促进Sirt3 表达，对小胶质细胞的抗炎作用可能经ERK/Sirt3 途径而实现，这为阐明依达拉奉的抗炎机制提供了新的方向。由于人体内影响因素多样，依达拉奉对中枢神经系统疾病的作用有待深入探索。