富含高溶性β-胡萝卜素油脂体系氧化稳定性及降解动力学研究

孙新怡, 孙清瑞,2, 李秀波, 金丽梅,2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1,大庆 163319) (国家杂粮工程技术中心2,大庆 163319)

β-胡萝卜素(C40H56)是一种常食用的类胡萝卜素,主要存在于胡萝卜、南瓜等果蔬中[1]。其分子结构中含有大量的共轭双键可起到猝灭单线态氧作用,从而具有高抗氧化活性,使其在防癌抗癌、心血管疾病、动脉粥样硬化等方面具有一定功效[2, 3]。作为一种脂溶性的色素,食品工业常选用价格较低的全化学合成或生物发酵法的β-胡萝卜素为原料,但其大多以全反式构型存在[4],且其在油脂基溶解度(不足1 mg/mL)和生物利用度普遍较低,而转化成顺式异构体后,其分子结构从晶态变为无定形分散态,其油脂基溶解度和生物利用度显著提高[5, 6]。因此,为达到其油脂基增溶增浓目的,可通过提高其顺式异构体的占比制得富含高溶性β-胡萝卜素油脂,并作为食品配料或功能食品原料,进一步应用于食品行业,这可极大地提高β-胡萝卜素的市场应用价值。

现有对全反式-β-胡萝卜素的研究表明,油脂基β-胡萝卜素在加工储藏过程中极易受到光照、氧气、温度等影响而降解[7, 8],Yang等[9]发现富含类胡萝卜素的油脂在光照和加热条件下储藏,类胡萝卜素降解规律符合一级动力学模型,且高温和光照会加速类胡萝卜素氧化。尹浩等[10]将β-胡萝卜素添加到油脂中进行分析,发现类胡萝卜素可提高油脂稳定性和延长其储藏期,但提高储藏温度,会加速油脂氧化。有关富含高溶性β-胡萝卜素油脂体系氧化规律及其降解动力学研究、以及组成体系(β-胡萝卜素和油脂)相互作用的研究鲜见报道。

以富含高溶性β-胡萝卜素油脂体系为研究对象,考察在不同储藏温度(-18、4、20、37 ℃)下,对不同油脂(大豆油、橄榄油、月见草油、鱼油)的抗氧化效果,同时通过建立降解动力学模型探讨橄榄油中β-胡萝卜素及其异构体在储藏过程中的氧化降解规律,考察β-胡萝卜素降解和油脂氧化之间的相互关系,旨在为β-胡萝卜素在保健油脂及食品配料行业的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

β-胡萝卜素(BC)晶体(纯度≥96%),精炼一级大豆油、特级压榨橄榄油、月见草油、鱼油(乙酯产品)(自测其过氧化值均值分别为3.11、6.52、5.03、3.84 mmol/kg;其中大豆油和鱼油分别被添加了TBHQ和维生素E;大豆油、橄榄油和月见草的β-胡萝卜素含量远小于0.1 mg/mL);无水乙醇、三氯甲烷、冰乙酸,均为分析纯;甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(MTBE),均为色谱纯。

YT-MS-100ML小型压力反应器,HPX-9052MBE电热恒温培养箱,1260 Infinity LC 高效液相色谱仪(DAD 检测器),液相色谱柱(C30柱250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 试验方法

1.2.1 富含高溶性β-胡萝卜素油脂的制备

准确称取150 mg β-胡萝卜素,将其置于含有15 mL油脂(大豆油、月见草油、橄榄油、鱼油)和15 mL乙醇的100 mL反应釜中,经CO2排氧后密封,继续通入CO2控制初始表压为0.8 MPa,加热搅拌反应(120 ℃,30 min,400 r/min),反应结束后冷却至室温,经缓慢泄压得到样品混合液,再经负压旋蒸脱除乙醇得到富含高溶性β-胡萝卜素油脂,所得样品用CO2排氧后-18 ℃冷冻备用,待使用时室温解冻且混匀。

1.2.2 富含高溶性β-胡萝卜素油脂氧化稳定性的评价

参考孙清瑞等[11]研究方法并进行适当修改,具体为:首先取1.2.1中备用样品,将其注满于3 mL的棕色样品瓶并密封,然后将该样品分别置于-18、4、20、37 ℃条件下避光储藏30 d,每隔6 d取样1次,分别按本文所列方法测定油脂的过氧化值和β-胡萝卜素含量。

1.2.2.1 过氧化值的测定

过氧化值(POV)测定参照GB 5009.227—2016。

1.2.2.2 β-胡萝卜素含量的测定

为准确测定β-胡萝卜素及其异构体含量,参考Jing等[12]测定方法并进行适当修改,具体为:准确称取适量富含高溶性β-胡萝卜素油脂样品,用乙酸乙酯定容至5 mL,用0.22 m滤膜过滤后,采用高效液相色谱(HPLC)法测定β-胡萝卜素的含量。

液相条件:乙腈100%,B相:甲基叔丁基醚100%,C相:甲醇100%;梯度条件:0～20 min,A相由25%减少到15%,C相由75%减少到35%,B相由0增加到50%,20～25 min,A、B、C三相保持不变,25 min时A相为25%,B相为0,C相为75%,25～35 min保持不变。样品处理溶剂:乙酸乙酯;流速:1 mL/min;柱温20 ℃;进样量5 μL;DAD测定波长为450 nm,扫描波长范围300～600 nm。

通过比对β-胡萝卜素标准品的保留时间、文献中各异构体的全波长扫描的特征峰[13],确定β-胡萝卜素顺、反异构体的结构。以面积归一化法定量检测β-胡萝卜素各异构体相对百分含量,以全反式β-胡萝卜素标准品的外标法定量产品中β-胡萝卜素总含量并计算其保留率,标准曲线方程:y=67.158x-159.53,R2=0.999 8

式中:y为峰面积;x为样品的质量浓度/μg/mL;线性范围为5～50 μg/mL。

1.2.3 油脂氧化动力学模型建立

以油脂的POV值为氧化动力学研究评价指标,其模型拟合方程[14]:

一级氧化反应动力学模型:lnSt=-kt+lnS0

(1)

零级氧化反应动力学模型:-St=kt-S0

(2)

式中:t为反应时间/d;k为比例系数S=1/[POV] /(mmol/kg)-1;S0和St分别对应开始和时间t时的S值。

通过Arrhenius方程,对油脂氧化速率常数的自然对数(lnk)和热力学温度的倒数(1/T)进行线性回归,其方程可改写为:

式中:A为指前因子;Ea为活化能/kJ/mol,R为理想气体常数8.314 J·K/mol;T为绝对温度/K;k为一级反应速率常数/d-1。

1.2.4 β-胡萝卜素降解动力学模型建立

β-胡萝卜素异构体含量随温度、时间的变化遵循一级反应动力学模型,其降解速率常数k和半衰期t1/2可通过式(4)、式(5)计算得出[15]。

式中:C为β-胡萝卜素异构体的油脂基质量浓度/μg/mL;C0为β-胡萝卜素油脂基初始质量浓度/μg/mL;t为反应时间/d。

β-胡萝卜素降解反应的活化能Ea同样可以使用Arrhenius方程进行线性回归,见式(3)。

1.3 数据处理

每个试验重复3次,结果取平均值,以均值±标准偏差(SD)表示。使用 Excel 2016 软件处理数据,Origin 8 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 高溶性β-胡萝卜素结构及组成分析

为明确β-胡萝卜素热处理前后的构型转化及异构体组成,通过HPLC对样品进行分析,结果如图1所示。由图1a可知,β-胡萝卜素原料中只含有全反式异构体,其质量分数为95.44%。图1b显示β-胡萝卜素经热致异构化反应后,含有明显的2个峰,与图1a中全反式异构体保留时间和闫红晓等[13]研究对照可知,该2个峰分别为全反式异构体(相对质量分数59.41%)和13Z-异构体(相对质量分数33.83%)。由分析可知,β-胡萝卜素共混于橄榄油-乙醇体系并经热处理后,促进了全反式β-胡萝卜素向油脂基溶解度更高的顺式异构体转化。

图1 β-胡萝卜素异构体的HPLC分析

通过1.2.1方法制备的不同油脂中β-胡萝卜素含量及顺式占比情况(表1)表明,该方法可制得富含高溶性β-胡萝卜素的油脂体系,其β-胡萝卜素质量浓度约为10 mg/mL,且β-胡萝卜素总顺式质量分数约为40%(其中BC-鱼油的略低),尽管所用油脂的脂肪酸组成不同,但对所制备的油脂基β-胡萝卜素含量及异构体顺占比的影响不显著,这可能归因于这些食用油分子的极性差异极小所致。

表1 不同油脂中高溶性β-胡萝卜素含量分析

2.2 富含高溶性β-胡萝卜素的油脂储藏氧化稳定性

2.2.1 储藏温度和时间对油脂POV的影响

分别在-18、4、20、37 ℃温度下,测定大豆油、橄榄油、月见草油和鱼油4种油脂的POV,结果如表2所示。富含高溶性β-胡萝卜素的橄榄油、大豆油、月见草油、鱼油的初始POV均值分别为6.63、3.28、5.16、4.01 mmol/kg。随着储藏时间的延长,4种油脂的POV均呈上升趋势,以大豆油为例,在温度为37 ℃时储藏30 d,其POV从4.02 mmol/kg增加到4.99 mmol/kg。并且储藏温度越高,油脂的过氧化值也越大,以月见草油为例,在-18、4、20、37 ℃ 4种不同温度下储藏30 d后,其氧化值分别为5.99、6.35、6.91、7.70 mmol/kg,其中37 ℃的POV 是-18 ℃的1.3倍左右。试验结果表明,尽管所制备的不同油脂体系富含β-胡萝卜素(约10mg/mL),但其也不能完全抑制试验条件下的油脂氧化。综合现有数据来看,以高溶性β-胡萝卜素为抗氧化剂可有效降低油脂的氧化劣变。市售4种油脂试验原料不可避免含有天然或合成的抗氧化剂,这些抗氧化剂对试验结果的影响,已在随后的2.2.2中的未含有高溶性β-胡萝卜素的油脂(空白油脂,即实验原料)加以讨论。

表2 储藏温度和时间对富含高溶性β-胡萝卜素油脂的POV影响

2.2.2 氧化动力学

为更好研究富含高溶性β-胡萝卜素油脂的氧化降解规律,分别用零级反应和一级反应动力学方程对4种油脂在不同温度条件下POV进行拟合。结果发现氧化过程同时具备零级和一级特征(R2>0.9),但是一级反应方程的回归系数普遍大于零级反应方程,拟合度更高,说明该试验更符合一级动力学方程,该结果与龙婷等[16]研究相符。在相同温度下,富含高溶性β-胡萝卜素油脂氧化速率常数均明显低于未添加β-胡萝卜素的空白油脂,如在37 ℃下,橄榄油空白样的氧化速率k为0.014 5,而BC-橄榄油k为0.004 6,明显低于空白样,说明β-胡萝卜素的加入有助于抑制油脂的氧化变质。随着氧化温度的升高,其速率常数随之增大,从-18 ℃到37 ℃,BC-大豆油的氧化速率k从0.006 2提升到0.009 5,说明β-胡萝卜素的抗氧化的效能随着油脂贮藏温度的升高而降低。

将一级油脂氧化速率常数的对数lnk与热力学温度的倒数(1/T)作图,如图2所示,并根据Arrhenius方程计算富含β-胡萝卜素油脂的活化能,结果如表3所示。4种富含高溶性β-胡萝卜素油脂的活化能不同,活化能越大,其氧化稳定性越高,从而推得其氧化稳定性顺序为BC-橄榄油>BC-大豆油>BC-月见草油>BC-鱼油,并且发现富含高溶性β-胡萝卜素油脂的活化能远高于空白油脂,其稳定性更好。有研究表明,油脂的氧化稳定性与油脂的脂肪酸组成密切相关[17]。其中富含高溶性β-胡萝卜素的橄榄油氧化最为缓慢,其活化能达到7.40 kJ/mol,这可能是由于橄榄油中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸(如油酸)含量高,因此在其贮藏过程中具有更高的稳定性;而鱼油的活化能最小为5.04kJ/mol,只有橄榄油的2/3左右,这是因为鱼油含有大量的多不饱和脂肪酸(如DHA、EPA),易被氧化生成大量氢过氧化物[18],同时氢过氧化物可能会进一步分解成醛、醇、酮及低级脂肪酸等挥发性成分,导致其氧化稳定性变差[18]。

图2 温度对富含β-胡萝卜素油脂氧化速率的影响

表3 不同储藏温度下富含β-胡萝卜素油脂的氧化动力学参数

2.3 油脂中高溶性β-胡萝卜素的储藏稳定性

2.3.1 高溶性β-胡萝卜素热降解动力学

为探究在储藏过程中β-胡萝卜素在不同温度下的热降解情况,选择氧化稳定性最佳的橄榄油进行试验,将富含高溶性β-胡萝卜素的橄榄油分别置于-18、4、20和37 ℃温度下避光储藏,经检测并统计分析得到β-胡萝卜素及其异构体的降解动力学曲线,因其曲线的趋势相同,这里仅给出总的β-胡萝卜素(Total BC)降解动力学曲线,如图3所示。结果表明,橄榄油中的β-胡萝卜素降解规律符合一级反应降解动力学模型,这与徐媛等[20]研究结论一致。随着储藏温度的升高,β-胡萝卜素及其异构体的降解速率常数成增加的趋势,表明高温储藏条件下,实验所用的高溶性β-胡萝卜素(顺式异构体质量分数约为40%)在橄榄油中易被氧化降解,这可能是油脂基高溶性β-胡萝卜素体系中所存微量氧作用所致,或有可能是油脂或β-胡萝卜素氧化降解产物的促氧化作用导致,这有待深入研究。

图3 β-胡萝卜素在不同温度下降解动力学曲线

β-胡萝卜素异构体在各温度下的降解动力学参数,如表4所示,结果发现在-18、4、20、37 ℃条件下总的β-胡萝卜素降解的半衰期分别为68.63、53.52、34.83、17.84 d,表明-18 ℃条件下β-胡萝卜素降解最缓慢,而37 ℃降解最快,且37 ℃条件下的降解速率最大,其k值是-18 ℃条件下3.85倍。β-胡萝卜素顺式或反式异构体也具有类似降解变化规律。根据Arrhenius方程,得到高溶性β-胡萝卜素(Total BC)降解速率随温度变化的回归方程为:y=-197 3.284 7x+2.913 3(y和x分别代表lnk和1/T),推得顺式异构体质量分数约为40%的β-胡萝卜素的活化能为16.41 kJ/mol。进一步地可推得β-胡萝卜素异构体活化能大小为All-E>TotalZ>13Z(表4),一般认为,一个化学反应的活化能越高,该化学反应越难以进行,所以β-胡萝卜素异构体中全反式异构体稳定性最好,不易被降解,这与文献报道结果一致[21]。该研究也表明,富含高溶性β-胡萝卜素橄榄油作为保健油使用,宜低温储藏。

表4 不同储藏温度下β-胡萝卜素异构体降解动力学参数

2.4 储藏过程中油脂氧化和β-胡萝卜素降解的相互关系

为探究富含高溶性β-胡萝卜素油脂体系中总的β-胡萝卜素降解与油脂氧化的相互关系,将两者变化进行线性拟合,设定St/S0=k1(C/C0)+k2,其中k1和k2为线性关系中的系数,S为橄榄油的[POV]-1。以油脂的St/S0对β-胡萝卜素的C/C0作图,如图4所示,发现不同温度条件下的线性相关系数R2均大于0.98,说明此模型线性特征非常明显,拟合直线能基本涵盖试验数据,具有一般性。同时发现不同温度下β-胡萝卜素含量与橄榄油S都呈正相关线性关系,即富含高溶性β-胡萝卜素(质量浓度约为10 mg/mL,顺式异构体占比约为40%)油脂体系中,随储藏时间的延长,总的β-胡萝卜素含量的不断减少,油脂POV逐渐增大。这说明,为提高富含高溶性β-胡萝卜素油脂体系氧化稳定性,应采取气调排氧、辅助添加其他抗氧化剂等措施。

图4 储藏过程中油脂过氧化值和β-胡萝卜素含量的相互关系

储藏过程中油脂氧化与β-胡萝卜素降解的相关性方程系数如表5所示,可以看出在不同储藏温度下其线性方程的k1和k2值均有较大差异,且随着温度升高,k1呈现增大趋势,这说明油脂氧化与β-胡萝卜降解关系随着温度的变化而改变,这可能是由于随着储藏温度的升高,β-胡萝卜素表现出更高的温度敏感性,使其易氧化降解,含量降低,对油脂氧化的抑制效果减弱。

表5 不同贮藏温度下油脂过氧化值和β-胡萝卜素含量线性关系的相关系数

3 结论

在富含高溶性β-胡萝卜素的不同油脂体系中,高溶性β-胡萝卜素对油脂抗氧化能力各不相同,其油脂氧化稳定性顺序为:橄榄油>大豆油>月见草油>鱼油,其中橄榄油氧化降解活化能最高,富含高溶性β-胡萝卜素的橄榄油稳定性最好。以高溶性β-胡萝卜素为抗氧化剂可有效降低油脂的氧化速率,抑制其劣变;在富含高溶性β-胡萝卜素的橄榄油体系中,随储藏时间延长,不仅橄榄油发生氧化反应,也同时伴随β-胡萝卜素的降解,其降解规律满足一级降解动力学模型,且随着储藏温度的升高,高溶性β-胡萝卜素降解越显著,从活化能角度来看,高溶性β-胡萝卜素中各异构体活化能高低依次为:All-E>TotalZ>13Z,表明全反式β-胡萝卜素的氧化稳定性最好;在探讨β-胡萝卜素降解与橄榄油氧化的相互关系的结果还发现,随着β-胡萝卜素的氧化降解,油脂的POV增大,其规律满足一定线性关联,且温度越高,该线性相关系数k1越大,表明富含高溶性β-胡萝卜素油脂宜低温储藏。在储藏过程中β-胡萝卜素的降解产物是否会加速油脂体系氧化,有待进一步研究。