玉兰叶多酚物质提取及特性研究

张 顺, 惠哲哲, 王宏亮, 杨 瑞, 梁 犇, 杨骏鹏,邱 莹, 宋凤敏, 刘存芳, 高艳红, 史 娟

(陕西省催化重点实验室;陕西理工大学化学与环境科学学院,汉中 723001)

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多酚类化合物。近年来,多酚类物质的生物活性及对人体的保健预防作用日益受到人们的关注,其清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管系统疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能的发现,使多酚的研究和应用越来越受到重视。据报道,抗癌防癌物中最有希望的一类植物化学物质即是多酚类抗氧化剂[1]。在全球老龄化与亚健康普遍化的当下,富含植物活性成分的保健品具有较为广阔的市场前景。利用植物多酚对人体的多种生理活性,将其开发为保健食品,食品添加剂、风味食品添加剂、风味剂成为绿色保健品的开发热点[2]。

广玉兰为木兰科、木兰属常绿乔木[3]。其叶和花含有多种挥发油、木兰碱、黄酮类、酚类等化学成分,常用于日常头痛腹泻、风寒呕吐、高血压、偏头疼等[4,5]。近年来,超声波技术多应用于植物中多酚、黄酮、多糖、皂苷、香豆素等生物活性物质的提取。与常规提取方法相比,超声波提取方法能提高有效成分的溶出速度、缩短提取时间、节省溶剂的消耗、提出率高[6]。目前,利用超声技术对玉兰叶中多酚的提取及其抗氧化性能的研究还鲜见报道。本实验采用超声波技术提取玉兰叶中的多酚,设计单因素试验考察料液比、提取时间、提取温度等对其多酚提取率的影响,并采用四因素三水平正交实验优化提取工艺[7-9]。并在此基础上研究其抗氧化性能及稳定性,旨在为进一步开发利用广玉兰资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料:广玉兰叶(采摘于陕西理工大学南校区)。

试剂:葡萄糖、没食子酸、福林酚试剂、硫酸亚铁、VC、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、水杨酸、氯酸铁、氯酸钾、DPPH、广玉兰叶、浓盐酸、碘化钾、可溶性淀粉、乙醚、无水乙醇、冰乙酸、三氯甲烷、酚酞、氢氧化钾、硫代硫酸钠等化学试剂均为分析纯。

1.2 设备和仪器

AR124CN电子天平,HHS电热恒温水浴锅,UV-2600紫外可见分光光度计,HG71电热恒温鼓风干燥箱,SB25-12 DTD超声波清洗机。

1.3 实验方法

1.3.1 多酚含量的测定

采用福林酚法测定玉兰叶多酚的含量,测得标准曲线回归方程为:

A=0.108 64C+0.105 11,R2=0.993 12

式中:A为没食子酸的吸光度;C为没食子酸的质量浓度。

1.3.2 多酚的提取与检测

将广玉兰叶在烘箱中60 ℃烘干,粉碎过60目筛装袋备用。准确称取1.0 g广玉兰叶粉末,加入提取溶剂乙醇,在超声波清洗仪中设定温度进行超声波提取后,常压过滤,滤液收集于100 mL容量瓶中,用提取溶剂乙醇定容[10]。取1 mL该样液于25 mL容量瓶中,并用提取溶剂定容,即为待测样品溶液。广玉兰叶中多酚的检测:取适当浓度的样品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入5.0 mL体积分数9.8%福林酚,摇匀反应5～7 min,加入4.0 mL质量分数7.7% Na2CO3溶液,摇匀静置1 h,于765 nm波长下检测吸光度值,同时以1.0 mL提取溶剂代替样品溶液作为空白对照[11]。根据测得的吸光度值按标准溶液回归方程计算样品溶液中总多酚浓度,进而计算广玉兰叶样品中总多酚质量分数(w)。

式中:c为测定液的质量浓度/mg/mL;V为测定液的体积/mL;n为扩大倍数;m为测定液的质量/mg。

1.3.3 单因素实验

对广玉兰叶中多酚的提取工艺进行优化,在超声波条件下,选取乙醇体积分数,料液比,超声时间,超声温度4个因素作为参考因子,寻找最佳提取条件。

1.3.3.1 料液比对多酚提取率的影响

称取1.0 g广玉兰叶粉末5份,选取料液比为1∶8、1∶16、1∶24、1∶32、1∶40,在乙醇体积分数为60%,超声时间30 min,超声温度60 ℃的条件下,研究料液比变化对多酚提取率的影响。

1.3.3.2 超声时间对多酚提取率的影响

称取1.0 g广玉兰叶粉末5份,在料液比1∶16,乙醇体积分数为60%,超声温度60 ℃的条件下,改变超声时间为20、30、40、50、60 min,研究时间对多酚提取率的影响。

1.3.3.3 超声温度对多酚提取率的影响

称取1.0 g广玉兰叶粉末5份,在料液比1∶16,超声时间40 min,乙醇体积分数为60%的条件下,改变超声温度为40、50、60、70、80 ℃,研究温度对多酚提取率的影响。

1.3.3.4 乙醇体积分数对多酚提取率的影响

称取1.0 g广玉兰叶粉末5份,在料液比1∶16,超声时间40 min,超声温度70 ℃的条件下,改变乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%,研究溶剂浓度对多酚提取率的影响。

1.3.4 正交实验设计

在单因素实验的基础上,以超声温度、超声时间、料液比和乙醇体积分数共4个因素,以玉兰叶多酚提取率为考察指标,选择L9(34)正交表进行正交实验,正交实验设计见表1。

1.3.5 玉兰叶多酚抗氧化活性实验

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性的测定

将2.0 mL的DPPH溶液分别和2.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL浓度样品溶液,充分混合均匀,在室温条件(27 ℃)下避光温浴30 min后用分光光度计在波长517 nm处测量吸光度A1。对照实验用等量的无水乙醇代替DPPH溶液测量吸光度A2[12],空白实验用等量的无水乙醇代替样品溶液测量吸光度A3。样品溶液对DPPH自由基的清除率计算公式:

1.3.5.2 羟自由基清除活性的测定

分别吸取6 mmol/LFeSO4溶液、6 mmol/L过氧化氢溶液、6 mmol/L水杨酸溶液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的样品溶液1 mL,使其充分混合均匀,并于40 ℃水浴中放置30 min后用分光光度计在波长510 nm处测吸光度为A1。取1 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液所测得的吸光度为A2;取1 mL无水乙醇代替样品溶液所测得的吸光度为A3[13]。样品溶液对羟自由基清除率的计算公式同1.3.5.1。

1.3.6 广玉兰叶中多酚的抗氧化活性稳定性实验

1.3.6.1 紫外光照射对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

取浓度为1.3 mg/mL多酚提取液装入100 mL容量瓶中定容并置于紫外光下,光源垂直距离为10 cm,分别照射1、2、3、4、5 h,以原液作为对照,测定其对DPPH自由基抗氧化性的变化,平行测定3次,取平均值[14]。

1.3.6.2 温度对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

取浓度为1.3 mg/mL多酚提取液分别装入4个100 mL容量瓶中定容,分别置于20、40、60、80 ℃条件下进行避光处理,分别测定处理1、2、3、4、5 h后,抗氧化性的变化。以原液作为对照,测定其对DPPH抗氧化性的变化,平行测定3次,取平均值。

1.3.6.3 添加剂对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

取浓度为0.3 mg/mL多酚提取液装入5 mL透明的玻璃管中,分为3组,分别加入浓度1.0 m的葡萄糖,柠檬酸,苯甲酸钠溶液1 mL,暗处理,并保证3组均在室温条件下进行。以原液作为对照,每隔2 h测定1次对DPPH自由基的清除率,平行测定3次,取平均值。根据结果来分析添加剂对DPPH自由基的活性变化。

1.3.6.4 氧化剂与还原剂对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

向3个100 mL容量瓶分别加入1.0 mL体积分数为 0.6%的H2O2溶液,1.0 mL浓度为0.06 moL/L的KClO3,1.0 mL浓度为0.06 moL/L的VC,30 ℃下搅拌反应后避光处理,以原液作为对照,分别测定处理2、4、6 h后,氧化剂和还原剂处理下其对DPPH清除能力的变化。

1.3.6.5 金属离子对玉兰叶多酚的影响

取质量浓度为0.3 mg/mL多酚提取液0.5 mL 9份,分别装入5 mL透明的试管中。并分别加入2 mL质量浓度为0.2 mg/mL的Fe3+,K+,Co2+,Zn2+,Ca2+,Na+,Cu2+,Mg2+,Al3+溶液,以蒸馏水作为对照,摇匀,在室温下避光放置1 h后,在517 nm处测定其酚类物质浓度,平行测次3次,取平均值。

1.3.7 广玉兰叶中多酚对油脂氧化败酸的影响

准确称取50 g油脂置于250 mL锥形瓶中,除空白对照,其他锥形瓶中以质量分数为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%的多酚提取液,混合均匀,置于(60±0.5)℃的恒温箱中,每隔24 h摇匀1次,并交换其在恒温箱中的位置。每5 d取样测定油脂的过氧化值和酸价。每个样品重复测定3次。

过氧化值和酸价的测定参照GB 5009.37—2003《食品安全国家标准 食用植物油卫生标准的分析方法》;根据GB 10146—2015《食品安全国家标准 食用动物油脂》和GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》,动物油中的过氧化值应≤0.2 g/100 g,约为7.9 mmol/kg,酸价应≤2.5 mg/g(以KOH计);植物油中的过氧化值≤0.25 g/100 g,约为9.9 mmol/kg,酸价应≤3.0 mg/g(以KOH计)[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 最佳料液比的确定

从图1可以看出,提取率与液料比并不具有一定的线性关系,提取率先随着料液比的增加而增加,当达到一定的提取率时,随着料液比的增加提取率反而下降。这是因为继续增加乙醇会导致其他醇溶性杂质溶出,影响测定结果,导致提取率下降[16]。因此最佳料液比为1∶16。

图1 不同影响因素的提取效果

2.1.2 最佳超声时间的确定

从图1可以看出,在一定范围内,广玉兰叶中多酚的提取率随提取时间的延长而不断提高,但当超声时间超过40 min后,提取率迅速变小,这可能是因为较长时间的超声处理影响了部分玉兰叶多酚的组成及结构,并且随着时间的延长,溶剂挥发也越多,进一步影响提取率[17]。故确定最佳超声时间为40 min。

2.1.3 最佳超声温度的确定

从图1可以看出,超声温度为40～70 ℃时,广玉兰叶中多酚提取率随温度的升高而增大,温度高于70 ℃时,提取率下降。这是由于温度过高,小部分溶剂挥发损失,导致多酚提取不完全。此外,温度过高,还可引起多酚变质或者分解[18]。综合各因素考虑,确定70 ℃为最佳超声温度。

2.1.4 最佳乙醇体积分数的确定

从图1可以看出,当乙醇体积分数为50%～80%时,多酚的含量随着乙醇体积分数的增大而增加,这是因为多酚类物质较易溶于乙醇,乙醇含量越大,广玉兰叶中多酚的析出越好。之后提取率略微下降,可能是因为乙醇体积分数的增大,其他一些醇溶性杂质溶出也增多,影响了多酚的测定,同时,乙醇体积分数过高会使蛋白质的变性,对乙醇提取多酚物质有一定的影响,阻碍多酚化合物的溶解。因此,选取最佳乙醇体积分数为80%。

2.2 正交实验的极差分析

由表2可知,最佳的提取条件是A2B3C3D2,即乙醇体积分数为80%,液料比为1∶16,超声时间为50 min,超声温度为80 ℃。由极差分析可知,在实验所选水平内4个因素对玉兰叶多酚提取率影响程度大小顺序为:超声温度>料液比>超声时间>乙醇体积分数。在最佳提取条件下进行3组验证实验,广玉兰叶中多酚得率的平均值为12.8%,即121.477 mg/g,高于正交实验中各条件的结果得率,证明该条件为广玉兰叶中多酚提取的最优工艺。

表2 正交实验的极差分析

2.3 玉兰叶多酚抗氧化活性实验

如图2所示,多酚对DPPH自由基和羟自由基均具有一定的清除作用,但对DPPH自由基清除能力明显优于羟基自由基,且随着浓度的增加而增加,增加较为明显。玉兰叶多酚对羟基自由基清除率也与浓度呈正相关。因为多酚对DPPH自由基清除作用明显,所以选用DPPH自由基作为玉兰叶多酚抗氧化稳定性的研究对象。

2.3.1 紫外光对玉兰叶多酚抗氧化性的影响

如图3所示,紫外光照射使广玉兰叶的多酚对DPPH自由基的清除率产生波动,但与对照实验相比,其波动范围很小且在6 h后仍保持良好的清除率,说明玉兰叶多酚对紫外线照射具有较好的稳定性。

图2 DPPH自由基与·OH清除活性的测定

图3 紫外光对玉兰叶多酚抗氧化性的影响

图4 温度对玉兰叶多酚清除DPPH的影响

2.3.2 温度对广玉兰叶提取液中多酚清除DPPH的影响

如图4所示,玉兰叶多酚在20、40、60、80 ℃条件下处理1 h后,室温20 ℃时的清除率最高。随着时间的增加,在室温20 ℃的条件下,玉兰叶多酚对DPPH自由基的清除率基本保持不变;在40 ℃和60 ℃的处理条件下,其对DPPH自由基的清除率在逐渐增大,并且趋于一致;在80 ℃的处理条件下,其对DPPH自由基的清除率相对稳定。在不同温度处理6 h后,玉兰叶多酚仍保持良好的清除能力,说明玉兰叶多酚对DPPH自由基的清除率受温度影响不大。

2.3.3 添加剂对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

如图5所示,2 h内,在3种添加剂的处理下,玉兰叶多酚清除DPPH的能力都呈现下降趋势,2～4 h 内略微增长,4～6 h又开始下降较小幅度。与对照实验相比,6 h后,经添加剂处理的多酚都降低了极大的清除能力。可见,多酚对DPPH自由基的清除能力在添加剂处理下是不稳定的。

图5 添加剂对玉兰叶多酚清除 DPPH 自由基的影响

2.3.4 氧化剂与还原剂对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

如图6所示,随着氧化时间的增加,氧化剂H2O2和KClO3对玉兰叶多酚DPPH自由基的清除能力趋于下降趋势,因为氧化剂消耗了玉兰叶多酚中大量的抗氧化成分;还原剂VC使其清除能力增强,这是因为VC对DPPH自由基具有还原作用。实验说明,在广玉叶多酚中添加一定量的H2O2,KClO3和VC能显著降低或提高玉兰叶多酚的抗氧化性。

图6 氧化剂与还原剂对玉兰叶多酚清除 DPPH 自由基的影响

2.3.5 金属离子对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

如图7所示,相对于初始玉兰叶多酚对DPPH自由基的清除能力,在9种金属离子处理后,添加了Na+和K+的溶液对DPPH自由基的清除能力变大;而其他Fe3+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+溶液,都使玉兰叶多酚对DPPH自由基清除能力降低,其中添加了Ca2+的溶液对DPPH自由基的清除能力下降最大。Cu2+和Fe3+虽然对清除能力影响不大,但使玉兰叶多酚溶液颜色迅速变深,说明广玉兰多酚不适合用铜质和铁质的器皿储存和加工,用铝制的容器较好。

图7 金属离子对玉兰叶多酚清除DPPH自由基的影响

2.4 广玉兰叶中多酚对油脂氧化败酸的影响

如图8、图9所示:在对大豆油及猪油添加不同质量分数的广玉兰多酚进行高强度氧化过程,同空白组做对照实验,表明不同质量分数的玉兰叶多酚对油脂的酸价和过氧化值具有抑制作用,且与多酚的质量分数有关。

图8 玉兰叶多酚对大豆油过氧化值的影响

图9 玉兰叶多酚对大豆油酸价的影响

3 结论

本实验采用超声波法提取玉兰叶多酚,取得了较好的效果。在单因素实验的基础上,通过正交实验选择出玉兰叶多酚的最佳提取工艺条件是:乙醇体积分数为80%,液料比为1∶16,超声时间为40 min,超声温度为80 ℃。各因素对生物碱提取率影响程度大小顺序为超声温度>料液比>超声时间>乙醇体积分数。并重复实验进行验证,多酚提取率均值为12.8%,即121.477 mg/g。本实验表明,利用超声波提取玉兰叶多酚的方法可行,具有提取时间短、原料少等特点。

抗氧化实验结果表明,多酚对DPPH自由基和羟基自由基都具有一定清除能力。但对DPPH自由基清除能力最强,而对羟基自由基的清除能力较弱。可以看出玉兰叶多酚具有明显的抗氧化活性,从资源利用的角度来看,广玉兰叶具有较大的开发潜力。

由玉兰叶多酚的抗氧化稳定性实验结果表明,在添加剂,氧化还原剂的处理下,玉兰叶多酚抗氧化稳定性较差。紫外光照和温度对玉兰叶多酚清除DPPH自由基稳定性影响较小。在9种金属离子的处理下,玉兰叶多酚适用于铝制的容器储存和加工。在对油脂的高强度氧化实验中,玉兰叶多酚对油脂的酸价和过氧化值均具有较好的抑制作用。