水飞蓟宾对哮喘小鼠气道黏蛋白Muc5ac的影响及机制研究

刘婷婷,黄志豪,杨红霞,张建勇

(1.遵义医科大学附属医院 呼吸与危重症医学科,贵州 遵义 563099;2.四川省自贡市第一人民医院 感染科,四川 自贡 683000)

支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘,是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病[1]。目前认为气道炎症是哮喘发病的主要机制,但气道炎症的确切发病机制并未完全阐明。研究表明,包括气道炎症在内的多种因素可导致气道黏液高分泌,引起气道黏液栓形成,阻塞气道,是致死性哮喘发生的重要因素和评估哮喘病情严重程度的独立危险因素[2-3]。水飞蓟宾是从水飞蓟中提取的一种天然类黄酮物质,研究表明其具有较强的抗炎活性[4]。本研究观察不同浓度水飞蓟宾对气道黏蛋白Muc5ac表达水平的影响,探讨水飞蓟宾对哮喘气道黏液高分泌的影响及其机制,为哮喘的治疗探索新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级6～8周龄雌性BALB/c 小鼠40只,购自湖南斯莱克实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。动物饲养及实验方案经遵义医科大学附属医院动物伦理委员会批准[NO:KLLY(A)-2020-076]。建模前,所有小鼠适应性喂养 1 周。

1.1.2 主要药品、试剂 鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、水飞蓟宾(Silybin,美国Sigma公司);氢氧化铝凝胶(英国Invitrogen公司);小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(中国依科赛生物公司);阿利新蓝-过碘酸雪夫(alcian blue/periodic acid schiff,AB-PAS)染色试剂盒、Masson染色试剂盒(北京索来宝生物科技有限公司);鼠抗细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,pERK)、转录因子SP1(transcription factor SP1)单克隆抗体(中国艾菲生物公司);鼠抗Muc5ac单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(中国博士德公司);二步法免疫组化检测试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器 压缩式雾化器 NE-C900[欧姆龙(大连)有限公司];Multiskan Spectrum酶标仪(美国BIO-RAD公司);Centrifuge 5417R、5415D离心机(德国Eppendorf公司);光学显微镜NIKON YS100(日本NIKON公司);IPWin32采图系统DM4000B(德国Lecia公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 将小鼠随机分为正常组(NS组)、哮喘组(AS组)、水飞蓟宾40 mg/kg组(Silybin40组)、水飞蓟宾80 mg/kg组(Silybin80组)、地塞米松组(DEX组),每组8只。AS组、DEX组、Silybin40组、Silybin80组于第1、13天予鸡卵清白蛋白/氢氧化铝凝胶溶液(40 μg OVA+1 mg 氢氧化铝)腹腔注射联合皮下注射致敏。第19～23天,以10% OVA溶液每次30 min,每天1次雾化激发。NS组致敏用PBS,激发用NS作为对照处理。AS组、DEX组、Silybin40组及Silybin80组分别于每次激发前30 min予PBS、地塞米松(dexamethasone,DEX)2 mg/kg、水飞蓟宾40 mg/kg及水飞蓟宾80 mg/kg腹腔注射。末次激发后 24 h 收样。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF) 炎症细胞分类及计数 1.25%阿佛丁(2,2,2-三溴乙醇)小鼠麻醉剂充分麻醉处死小鼠后,行气管插管术,计数细胞总数,剩余予PBS进行支气管肺泡灌洗以制备支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),灌洗液经离心后取细胞沉淀重悬,涂片制片后行瑞士-吉姆萨染色,计数细胞总数及嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)百分比。

1.2.3 BALF的IL-6、TNF-α水平检测 按试剂盒说明书操作,在 450 nm 波长下进行读数,根据标准曲线计算各相应指标的浓度。

1.2.4 肺组织病理切片HE、AB-PAS染色 小鼠肺组织用4%多聚甲醛浸泡固定 24 h,石蜡包埋,以4 μm厚度切片,行 HE、AB-PAS染色。对HE染色切片进行支气管周围炎症细胞浸润评分,5个评分标准分别为无、少许、较多分布不均匀、大量均匀不成团、大量均匀并成团,分数为0～4分。AB-PAS染色:有酸性、中性及混合黏液物质及细胞表达,分别呈现蓝色、红色及紫红色。应用Image Pro Plus6.0图像分析软件测量气道黏液物质相对着色面积进行定量分析。

1.2.5 免疫组织化学(IHC)分析 石蜡切片经脱蜡、水化、3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶、柠檬酸盐抗原修复、山羊血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育、DAB显色、苏木素复染细胞核、盐酸酒精分化、脱水中性树胶封片,显微镜镜检,图像采集并用Image pro plus6.0软件测量目标蛋白的阳性面积,以积分光密度(integral optical density,IOD)表示。

2 结果

2.1 水飞蓟宾对哮喘小鼠BALF细胞总数及EOS的影响 AS组的BALF细胞总数及EOS百分比较NS组增加(P<0.05);与AS组相比,DEX组、水飞蓟宾组BALF细胞总数及EOS百分比均降低(P<0.05),详见表1。

表1 各组小鼠BALF细胞总数和EOS的变化

2.2 水飞蓟宾对哮喘小鼠BALF的细胞因子IL-6、TNF-α的影响 AS组小鼠BALF的细胞因子IL-6、TNF-α水平较NS组升高(P<0.05),且IL-6升高更明显。与AS组相比,水飞蓟宾及地塞米松干预组IL-6、TNF-α水平均下降(P<0.05),详见表2。

表2 各组小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平的变化

2.3 水飞蓟宾对哮喘小鼠气道炎症的影响 与NS组相比,AS组肺组织表现出明显的病理改变,包括明显的炎症细胞浸润、气道上皮黏膜不完整,气道上皮细胞及杯状细胞增生,管壁增厚,管腔狭窄,气道黏液分泌增多,部分管腔内可见黏液栓,将管腔完全阻塞(P<0.05)。而水飞蓟宾及地塞米松干预组小鼠肺部炎症反应、气道黏液分泌较AS组减轻(P<0.05)。详见表3、图1。

A:NS组气道上皮细胞排列整齐,气管及肺血管周围少量炎症细胞浸润;B:AS 组气道大量黏液堵塞,气管及肺血管周围大量炎性细胞浸润;C～E:DEX组、Silybin40组与Silybin80组管腔通畅,气道周围少量炎性细胞浸润;HE×200。

表3 各组小鼠支气管周围炎症细胞浸润病理评分比较

2.4 水飞蓟宾对哮喘小鼠气道黏液物质分泌的影响 AS组可见大量黏液物质阻塞气道,气道上皮杯状细胞增生,其表达高于NS组、Silybin40组、Silybin80组,而Silybin40组高于Silybin80组,以上组间差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2、表4。

A:NS组气道中见极少杯状细胞,未见黏液分泌;B:AS组气道周围可见大量的杯状细胞,大量黏液分泌堵塞气道;C～E:DEX组、Silybin40组与Silybin80组管腔通畅,气道中见少量杯状细胞,黏液分泌较少;AB-PAS×200。

表4 各组小鼠气道黏液物质相对着色面积的变化

2.5 水飞蓟宾对哮喘小鼠的ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表达的影响 AS组显示肺组织中pERK蛋白表达较NS组增加(P<0.05)。与AS组相比,水飞蓟宾或地塞米松处理组ERK的磷酸化水平均降低(P<0.05)。Muc5ac、SP1蛋白的表达与pERK的变化趋势一致(P<0.05)。而ERK在各组之间表达无明显差异(P>0.05)。详见表5、图3。

AS组小鼠肺组织中pERK、SP1、Muc5ac 的表达呈强阳性,NS 组表达较弱;水飞蓟宾及地塞米松干预后上述蛋白的表达较AS 组进一步减弱;而ERK的表达在各组之间表达无明显差异;标尺为50 μm,放大倍数为×200。

表5 各组小鼠ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表达IOD变化

3 讨论

哮喘是一种由T细胞、EOS及肥大细胞等多种炎症细胞及细胞组分参与的慢性气道疾病[5]。目前普遍认为气道炎症和气道重塑是哮喘的重要病理特征,两者可导致气道黏液高分泌,进一步加重气道阻塞[2,6-7]。气道黏液高分泌的病理基础是气道上皮杯状细胞增生、化生及黏液腺增生肥大以及由此导致的气道黏蛋白Muc5ac水平升高[8-9]。但哮喘气道黏液高分泌涉及多种细胞及细胞信号转导通路的参与,其确切的发生与调节机制尚未完全阐明。GINA及我国哮喘防治指南均推荐吸入性糖皮质激素作为一线治疗药物。但部分患者存在激素抵抗、治疗效果不佳,且长期大量吸入糖皮质激素可能出现不良反应,因此,寻求新药及作用靶点,长期稳定控制哮喘症状,对提高哮喘患者生活质量具有重要的意义。

水飞蓟宾是一种从植物水飞蓟中分离出来的多酚类化合物。研究证明,水飞蓟宾具有保肝、抗炎、抗氧化、抗纤维化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及神经保护等广泛的药理作用[10-15]。Choi等[16]研究发现,水飞蓟宾通过抑制NF-κB途径减少Th2促炎细胞因子的分泌,使OVA诱导的IFN-γ水平升高,从而调节Th1/Th2细胞平衡。EOS是参与哮喘气道慢性炎症的重要炎性细胞,其趋化受到Th2辅助细胞因子(如IL-4、IL-13)、促炎因子(如IL-6、TNF-α)以及特定的协调趋化因子(如EOS趋化因子和黏附因子)等多种细胞因子的调控[17]。IL-6和TNF-α可上调EOS趋化因子和黏附因子,引起EOS募集,促进细胞因子释放,导致气道慢性炎症反应及气道高反应性等[18]。另外,气道黏液分泌受到ERK/SP1信号通路的调节,SP1转录位点的突变时会导致Muc5ac合成降低,当SP1上游的ERK信号通路异常激活时,ERK持续磷酸化,SP1与Muc5ac基因启动子持续结合,导致Muc5ac高分泌;而抑制ERK磷酸化,可减少Muc5ac分泌和炎性细胞因子、炎性细胞数量的产生,减轻哮喘症状,减缓气道重塑过程[19]。

本研究通过卵清蛋白致敏与激发构建哮喘小鼠动物模型,发现 AS 组小鼠在激发过程中表现出毛发竖起、抓耳挠腮、呼吸急促、大小便失禁,甚至出现躁动不安或活动迟缓等表现,且气道炎症评分、BALF 总细胞计数、EOS百分比、促炎细胞因子IL-6、TNF-α水平、气道黏液物质着色面积及黏蛋白Muc5ac水平均较NS组显著升高,提示成功建立哮喘小鼠模型。本研究结果表明哮喘小鼠气道上皮细胞磷酸化ERK和SP1表达水平较NS组升高。而不同浓度水飞蓟宾可减轻哮喘小鼠气道炎症水平,降低BALF细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平,使气道上皮细胞磷酸化ERK和SP1表达减少,气道黏蛋白Muc5ac水平降低。水飞蓟宾的治疗作用可能与抑制ERK磷酸化和SP1表达有关[20]。即水飞蓟宾可能通过抑制ERK/SP1信号通路,减少炎性细胞因子IL-6、TNF-α表达,抑制气道炎症和气道黏蛋白Muc5ac分泌。本实验地塞米松干预组气道炎症与气道黏蛋白Muc5ac较AS组明显减低,提示糖皮质激素可能通过多个环节全面抑制哮喘的气道炎症及气道黏液高分泌。

综上所述,水飞蓟宾干预可抑制哮喘小鼠气道炎症和气道黏液高分泌,其机制可能与抑制ERK/SP1信号通路有关。由于哮喘病理生理机制的复杂性及哮喘的药物治疗仍面临新的挑战,水飞蓟宾在哮喘治疗中的作用、确切机制及未来的临床应用前景尚需更进一步的研究。