生物钟核心基因多态性与缺血性脑卒中疾病的关联性

施海媛， 谭沙一君， 李路明， 刘如， 刘逊， 何明利

急性缺血性卒中发病时间具有一定的昼夜节律特点，如常见卒中发病形式有醒后卒中，急性缺血性卒中发病高峰时间为上午的6∶00―12∶00，占24 h全部时段的79%［1］。随着对昼夜节律现象的深入研究，我们了解到地球上生物体表现的昼夜节律特性，其内在机制为生物钟及维持生物钟运行的生物钟基因［2，3］，那么，是否可以从生物钟基因的角度来揭示缺血性脑卒中的发病规律呢？另一方面，生物钟基因及其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与脑卒中的诸多危险因素如高血压、糖尿病、血脂异常等密切相关［4-7］，既然生物钟基因及其SNPs与缺血性卒中的多项致病危险因素相关，且急性缺血性脑卒中发病本身具有一定的节律特性，那么，生物钟基因与缺血性脑卒中本身是否有直接的联系呢？课题组前期研究确定了与缺血性卒中密切相关的生物钟基因位点为ARNTLrs6486122、PER1rs2253820，本文旨在进一步探索ARNTLrs6486122、PER1rs2253820与缺血性卒中发病是否具有关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象资料 收集2021年9月―2022年9月就诊于江苏省连云港市第一人民医院的确诊为缺血性卒中，且排除出血性卒中及严重肝肾功能损害的1 012例患者作为缺血性卒中组。将同期我院住院患者未患有缺血性卒中的人群及体检中心接受检查的共958例患者作为对照组，通过病史采集及实验室检查收集所有研究对象人口学资料（年龄和性别）、缺血性卒中常见危险因素（高血压、糖尿病、血脂异常），入院时检测指标（身高、体重、血压、实验室检查）等。

1.1.2 SNPs位点信息ARNTLrs6486122、PER1rs2253820SNP位点信息（见表1）。

表1 SNPs位点基本信息

1.2 SNPs基因型检测

采集研究对象的外周静脉血1 ml于EDTA-K2抗凝管，保存于-80 ℃冰箱，待样本全部收集齐后统一检测。使用DNA试剂盒提取DNA。使用SNaP-shot技术进行基因型检测，首先进行引物设计合成，预扩增包含SNP位点的片段后，去除多余的预扩增引物及dNTP，随后进行延伸反应，延伸引物对纯化后的预扩增产物模板，进行单碱基延续。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，最终上机检测并进行数据分析（见表2）。

表2 预扩增引物

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象纳入情况及基本特征

采用病例对照研究设计纳入缺血性卒中组1 012例，对照人群组958例，在两组比较中，卒中组的年龄、性别、是否患有高血压、糖尿病、血脂异常以及入院后测量的相关指标（收缩压、舒张压、空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇）均较对照组有显著性差异（P< 0.001）（见表3）。

表3 研究对象的基本特征

2.2 SNPs基因型分布情况

2.2.1 SNPs基因型谱检测图 使用SNaPshot技术进行基因型检测，我们发现PER1rs2253820、ARNTLrs6486122 SNPs位点的具体基因型，rs2253820（T>C）分别有TT、CT、CC 3种基因型，rs6486122（C>T）分别有CC、CT、TT 3种基因型（见图1）。

图1 基因型谱检测展示图

2.2.2 研究对象SNPs的基因型分布及遗传平衡检验 本研究中ARNTL-rs 6486122、PER1-rs 2253820两个位点检出率为100%，对于ARNTL-rs 6486122位点，检出CC、CT、TT 3种基因型，分别在卒中组有387例，520例，105例，在两组间分布具有统计学差异（P=0.036）；PER1-rs 2253820位点检测出TT、CT、CC 3种基因型，分别在卒中组分布349例，543例，120例，在对照组和卒中组间分布具有显著性差异（P<0.001）。对于对照组进行哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）检验，两个位点检出基因型均符合哈迪温伯格平衡（见表4）。

表4 研究对象基因型分布及HWE检验

2.2.3 基于不同危险因素SNPs的基因型分布 基于卒中人群不同危险因素，我们进一步统计了ARNTL-rs 6486122，PER1-rs 2253820的3种不同基因型的分布情况（见表5、表6），对于ARNTL基因的rs 6486122位点，不同危险因素下，3种基因型分布均无统计学差异（均为P> 0.05）。对于PER1基因rs 2253820位点，年龄、高血压病史以及SBP值在3种基因型分布中具有统计学差异（P< 0.05）。

表5 基于不同危险因素下的rs 6486122基因型分布情况

2.3 SNPs与缺血性卒中的关联性

在对照组和卒中组危险因素比较中，经多因素回归分析后，年龄作为缺血性脑卒中的危险因素，较对照组比较具有显著统计学差异，随着年龄增长脑卒中的患病风险显著增加（P<0.001，OR=6.704，95%CI5.188~8.644）；高血压患者较非高血压患者，患缺血性脑卒中的风险增加2.565倍（P<0.001，OR=2.565，95%CI1.971~3.338）；血脂异常患者较血脂正常人群，患缺血性脑卒中的风险增加1.700倍（P=0.001，OR=1.700，95%CI1.230~2.348）；收缩压及舒张压增高，同样也会增加卒中的患病风险。对于PER1基因的rs2253820位点，以野生纯合子TT基因型为参比组，CT基因型，CC基因型以及显性遗传模型在增加脑卒中的发病风险方面均具有统计学差异（CT vs TT：P=0.001，OR=1.552，95%CI1.194~2.018；CC vs TT：P=0.024，OR=1.295，95%CI1.035~1.621；显性模型：P=0.001，OR=1.563， 95%CI1.215~2.012）。对于ARNTL基因的rs6486122位点，经校正后，各基因型与遗传模型与缺血性脑卒中发病关联性无统计学意义（P>0.05）（见表7）。

表7 多因素Logistic回归分析

3 讨论

缺血性脑卒中是常见的脑血管疾病，多表现有不同程度的神经功能缺损症状，目前对于缺血性脑卒中的研究多从控制危险因素入手，达到减少卒中发生的可能性。随着预防卒中的防治任务日益加重，我们对于卒中的研究不仅仅局限于外因，越来越多从内在基因遗传的角度寻找预防、诊治缺血性脑卒中的新靶点。

地球上的生命体多表现出一定的昼夜节律，这与外部环境变化与机体内部生物钟基因的调节密不可分。越来越多研究证明，当人体外部环境发生变化或其他原因造成生物钟基因的改变，生物节律发生紊乱，则会大大增加人类罹患心脑血管疾病的风险［5］。多项研究证明，生物钟基因SNPs与高血压［8］、血脂异常［9］、糖尿病［10］等的发病风险有关。而生物钟基因SNPs与缺血性脑卒中的疾病直接关联性却少有研究。

本研究发现，PER1rs2253820位点突变可能与缺血性卒中的发病有关，而ARNTLrs 6486122位点基因型及遗传模型比较在经多因素校正后，与缺血性脑卒中发病无明显统计学意义。既往研究表明，PER1基因是生物钟基因的核心基因［11］，本课题组前期研究通过对短暂性大脑中动脉闭塞的自发性高血压大鼠的PER1rs2253820位点监测，rs2253820通过CK1加速PER1磷酸化，在敲除rs2253820位点后，减弱了昼夜节律的干扰，从而抑制生物钟基因BMAL1和CLOCK的转录，最终加重的自发性高血压大鼠的血压变异，这说明rs2253820位点突变与卒中后血压变异有一定的关联性［12］。一项针对汉族人群的病例对照研究显示，PER1rs2253820 的遗传多态性和昼夜节律紊乱可能增加另一种神经退行性疾病——帕金森病的发病风险（P=5.30×10-6，OR=1.31）［13］。另外，在一项对自闭症致病因素的研究中，Nicholas等在11个生物钟基因的多个SNPs中发现PER1rs2253820与自闭症存在显著关联性（P<0.05）［14］。由此可见，PER1rs2253820位点突变导致昼夜节律紊乱与多种疾病相关联，本文进一步探索其与缺血性脑卒中的关联性。

一项关于基因多态性与缺血性脑卒中的病例对照研究发现MMP2rs243849位点与缺血性卒中发病风险显著相关（P=0.005）［15］。本文同样采用病例对照的研究方式，经过多因素Logistic回归分析后发现，以PER1rs2253820的野生纯合子TT基因型为参照，CT基因型、CC基因型以及显性遗传模型均具有统计学差异，突变的C等位基因可能增加脑卒中的发病风险（见表7）。同时，经多因素校正后，年龄、高血压、血糖升高等指标依旧是缺血性脑卒中的独立危险因素，这也与既往多项研究结果一致［4，16］。本研究一方面证实了既往被大家所熟知的危险因素依旧是缺血性脑卒中的发病危险因素；另一方面新发现了生物钟基因多态性PER1rs2253820与缺血性脑卒中的发病密切相关，这为进一步研究缺血性卒中的发病、诊断及早期预防，攻克缺血性脑卒中这一难题提供了新的解题思路。

本研究存在一些不足，比如研究对象局限为中国汉族地方人群，考虑到遗传背景及环境变异等情况，研究结论需进一步大样本量和多地区人类种族进行验证。另外，缺血性卒中的发病及其影响因素多样且复杂，尽管进行了多重因素校正，尽可能排除了干预因素影响，然其研究结论仍需更严谨的实验加以论证。

伦理学声明：本研究方案经由连云港市第一人民医院伦理委员会审批（批号：KY-20210903001-01），在中国临床试验注册中心注册（注册号：ChiCTR2200064854），患者均签署知情同意书。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：施海媛负责设计论文框架，起草论文；施海媛、谭沙一君负责实验操作，研究过程的实施；施海媛、李路明、刘如，刘逊负责数据收集，统计学分析、绘制图表；施海媛负责论文修改；何明利负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。