基于网络药理学探究“葫芦巴-迷迭香”提取物治疗Ⅱ型糖尿病的潜在作用机制及实验验证*

张彦昕，柴贝贝，石玉节，李海利

(1.郑州赛科药业科技有限公司，河南 郑州 450000；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450000)

近年来，全世界范围内糖尿病的患病率约为10%，糖尿病是一种表现为高血糖的代谢病，由胰岛素分泌异常、胰岛素抵抗或这两种因素共同导致，其中Ⅱ型糖尿病(T2DM)高达90%。发展到一定程度可以出现许多并发症[1]，作为全球流行病，T2DM对世界各国人民健康造成极大危害[2]，被评为世界第四大易致死性疾病。

葫芦巴是豆科属的一种草本植物，又名胡卢巴，具有多种生物功效，中医常用于温肾补阳、祛寒止痛。近几年有研究发现葫芦巴碱与胰岛素分泌、参与糖代谢过程酶的活性、体内活性氧、神经元兴奋性等密切相关[3]，卢芙蓉等[4]探究葫芦巴总皂苷可以抑制链脲佐霉素诱导大鼠血小板聚集和血小板活化同时可以降低血糖升高胰岛素水平。葫芦巴的种子有助于降低食物中血糖负荷的成分，从而减少碳水化合物和单糖对血糖的影响[5-6]。

迷迭香是一种芳香的常绿灌木植物，属于唇形科，原产于地中海地区和南美洲，其鲜叶和干叶已被广泛用于调味和传统药物。历史上，迷迭香被用作药物治疗肾绞痛和痛经、刺激头发生长、缓解呼吸系统疾病。在现代医学，迷迭香提取物经常用于治疗与焦虑相关的疾病，同时药理学研究表明，迷迭香提取物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗高血糖的特性[7-12]。

中药具有多途径、多成分、多靶点的特点，网络药理学方法能够从中药调控的整体进行分析，具有快速高效的特点，因此被越来越广泛的应用到中药药理作用解析中[13-16]。本研究基于网络药理学特点，构建“葫芦巴-迷迭香”治疗Ⅱ型糖尿病蛋白网络，解析其治疗Ⅱ型糖尿病的作用机制，并通过动物实验进一步验证。

1 网络药理学研究

1.1 中药活性成分及其靶点收集

运用 BATMAN-TCM数据库，以拉丁名检索，收集葫芦巴和迷迭香所有的有效活性基因分子，在设置参数处设定P值为0.1进行筛选，得到其有效活性成分；用PubChem数据库获取各活性成分的SMILES号，导入SwissTarget Prediction数据库预测各成分对应的靶点。

1.2 疾病靶点收集

以“Type 2 diabetes”为关键词，使用GeneCards靶点数据库(筛选条件：相关性>40)、OMIM数据库、DisGeNET数据库搜索及筛选糖尿病的靶标基因，删除重复靶点，得到Ⅱ型糖尿病相关疾病靶点。

1.3 葫芦巴-迷迭香治疗Ⅱ型糖尿病的靶点预测(韦恩图)

利用韦恩图制作在线网站绘制出“葫芦巴-迷迭香”作用靶点与Ⅱ型糖尿病疾病靶点交集的韦恩图。

1.4 葫芦巴-迷迭香治疗Ⅱ型糖尿病蛋白质互作网络(PPI)构建

为清楚地解析“葫芦巴-迷迭香”与糖尿病之间的蛋白信息，将葫芦巴-迷迭香和疾病靶点合集导入STRING在线数据库，选定物种为“智人”，中等置信度设置>0.7，进行靶点PPI网络图构建。

1.5 基因本体(GO)及通路分析

为了研究“葫芦巴-迷迭香”中活性成分的靶点在基因和通路的作用，利用Metascape网站输入重复靶点基因，依据P<0.01，筛选“葫芦巴-迷迭香”治疗Ⅱ型糖尿病的信号通路和生物过程并进行分析，利用微生信在线平台生成基因富集气泡图。

成语中还有很多古今异义的现象，比如“走马观花”中的“走”是“跑”的意思，而非“行走”之意。“赴汤蹈火”中的“汤”是“开水”的意思，并不是“菜汤”之意。“感激涕零”中的“涕”是“眼泪”之意，并不是“鼻涕”之意。

2 实验研究

2.1 实验动物

雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠50只(200±20)g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008。饲养于焦作赛科动物实验中心，饲养环境：室温(25±2)℃，12 h 黑暗/12 h 人工光照，标准饲料喂养，自由饮水，适应性饲养一周。

2.2 试剂与仪器

葫芦巴和迷迭香提取物(HMTQW)由郑州赛科研发中心提取纯化得到，复配为低剂量(0.5 g/kg)、中剂量(1.0 g/kg)、高剂量(2.0 g/kg)；链脲佐菌素(STZ，美国 Sigma)；柠檬酸、柠檬酸钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；甘油三酯试剂盒(TG)、胆固醇试剂盒(TC)、低密度脂蛋白试剂盒(LDL-C)、高密度脂蛋白测定试剂盒(HDL-C)(均购于上海科艾博生物技术有限公司)；酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(赛默飞世尔)；多功能酶标仪(TECAN 瑞士)。

2.3 动物分组及造模

1)动物分组 将50只健康SD大鼠随机分为空白组、Ⅱ型糖尿病模型组和HMTQW低、中、高剂量治疗组，每组10只。

2)糖尿病模型的建立 空白组正常饮食，模型组和给药组大鼠使用高糖高脂饲料喂食8周，术前禁食 12 h，腹腔注射2%STZ，剂量 45 mg/kg，空白组腹腔注射等剂量的柠檬酸缓冲液。注射七天后，大鼠尾静脉采血，测量空腹血糖，判断标准为血糖范围≥13.0 mmol/L，同时出现多饮、多食、多尿现象，表明模型建立成功。

3)实验给药 模型建立成功次日开始药物治疗，每天灌胃给药2次，连续给药4周。

3 结果

3.1 筛选中药活性成分及其靶点收集

BATMAN-TCM数据库设置参数后得到“葫芦巴-迷迭香”有效活性成分56个，其中葫芦巴的活性成分33个，迷迭香的活性成分23个，经筛选(活性成分与靶点相关度>0.1)后得到靶点764个。

3.2 疾病靶点筛选结果

通过Genecards、DisGeNET数据库检索“Type 2 diabetes”得到相关基因，收集基因信息(Relevance Score>40)，删除重复基因后共获得554条基因结果。

3.3 中药治疗疾病靶点韦恩图

将活性成分靶点与T2DM 靶点绘制韦恩图(见图1)，二者重合区域即为交集基因，得到126个靶基因。

3.4 蛋白质互作网络(PPI)构建及其核心基因分析

交集靶点互作(见图2)共得到126个节点，726条边，平均节点度值12.1，局部聚类系数0.484。说明“葫芦巴-迷迭香”提取物治疗 T2DM 的作用机制可能与这 126个潜在靶点有关。蛋白交互筛选到关键靶点如表1所示。

图1 药物活性成分与疾病靶点韦恩图

注：节点为交集靶点蛋白，边为蛋白之间的互作关系图2 “葫芦巴-迷迭香”提取物与 疾病交集靶点的蛋白互作网络图

表1 部分关键靶点

3.5 基因富集与通路结果分析

取前20位进行GO分析和KEGG通路富集分析(见图3)，GO富集共确定了497个条目，其中细胞组分富集有95条，包括膜筏、膜微结构域、质膜筏、受体结合物等；分子功能富集有134条，包括蛋白激酶活性、配体激活转录因子活性、磷酸转移酶活性、磷酸酪氨酸活性等；生物过程富集有268条，包括正向细胞因子迁移、血管生长、上皮细胞增殖等。KEGG通路分析主要涉及 癌症通路、AGE-RAGE 信号通路、糖尿病心肌炎、钙通道、PI3K/Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、HIF-1信号通路等。通路与富集靶点数目见表2。

图3 GO、KEGG富集结果

表2 靶向通路及其靶点数目

3.6 网络图构建

“葫芦巴-迷迭香-活性成分-靶点”网络图如图4，“葫芦巴-迷迭香-活性成分靶点-疾病靶点-疾病”网络图如图5。

注：绿色节点是药物，黄色节点是活性 成分，红色节点是靶点图4 “葫芦巴-迷迭香-活性成分-靶点”网络图

注：黄色节点是药物，红色节点是成分靶点， 绿色节点是疾病，紫色节点是疾病靶点图5 “葫芦巴-迷迭香-活性成分靶点-疾病 靶点-疾病”网络图

3.7 动物实验研究结果

3.7.1 空腹血糖水平比较结果

与空白组比较，糖尿病模型组的血糖明显升高，给药低剂量组结果有下降趋势，但未见显著性差异，中剂量与高剂量给药组与模型组相比可降低大鼠血糖水平，见图6。

与空白组比较，###P<0.001； 与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01图6 大鼠空腹血糖水平比较 (n=10)

3.7.2 血清中甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平结果

与空白组比较，糖尿病模型组血清中总甘油三酯和总胆固醇升高，高密度脂蛋白胆固醇降低，低密度脂蛋白胆固醇升高，与模型组相比，给药组低剂量没有显示出明显降低血清中总甘油三酯的作用，给药组中剂量和高剂量具有一定作用，如图7(a)；与模型组相比，给药组低剂量和中剂量没有显示出明显降低血清中总胆固醇的作用，高剂量给药干预后，大鼠血清中总胆固醇下降，如图7(b)；与空白组比较，模型组的高密度脂蛋白胆固醇降低，低密度脂蛋白胆固醇升高，经给药后可看出低剂量组结果与模型组没有显著性差异，中剂量和高剂量组显示出良好的干预效果，如图7(c)、 7(d)。

(a) (b) (c) (d)

3.7.3 血清中炎性因子，血管内皮细胞生长因子和表皮细胞生长因子水平结果

与空白组比较，糖尿病模型组血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平显著升高，VEGF及EGF含量明显降低；与糖尿病模型组相比，HMTQW低剂量组没有明显差异，HMTQW中剂量和高剂量组血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平下降，VEGF和EGF水平均明显升高，具有统计学意义，见图8与图9。

(a) (b) (c)

(a) (b)

4 讨论

葫芦巴与迷迭香中所含有的多种化合物发挥着稳定且多样的植物药理学功能，广泛用于香料、食品、医药行业。血脂、胆固醇升高，急、慢性并发症，血糖水平异常，胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病患者显著的特征。

4.1 “葫芦巴-迷迭香”提取物可降低血脂、血糖

与癌症通路相关的凋亡细胞如MAPK1和MMP9等在肥胖、糖尿病等疾病中发挥重要作用[17]。体外研究表明，迷迭香具有胰岛素样作用，可抑制肝细胞产生葡萄糖，显著抑制HepG2肝细胞的糖异生。在另一项研究中，迷迭香提取物调节AMPK和PPAR信号通路增加肝细胞的葡萄糖消耗。此外，细胞内糖原含量显著降低，糖酵解率增加[18-20]。

4.2 “葫芦巴-迷迭香”提取物可减少糖尿病并发症

糖尿病视网膜病变是糖尿病的微血管并发症。在糖尿病微血管系统中，细胞内高血糖通过炎症反应、内皮细胞与足细胞的交互作用以及外泌体等多种病理生理过程导致血管内皮损伤。

作为代谢最活跃的组织之一，视网膜对生物机体血糖水平的波动极其敏感。视网膜内皮细胞因缺血、氧化应激和促炎因子的释放而受损。TNF是糖尿病视网膜病变相关研的关键靶标，参与与肥胖有关的Ⅱ型糖尿病的生理、病理过程[21]，研究表明，IL-1、TNF-b、VEGF和NF-kB均可刺激内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达[22-24]。GO富集关键靶点血管内皮因子A(VEGFA)对血管内皮细胞的分化、增殖和存活尤其重要，可促进内皮依赖性血管舒张和提高血管通透性[25]。葫芦巴中剑麻皂素可上调VEGFA表达，从而减少患者视网膜病变的发生。

PI3K/Akt/mTOR通路是糖尿病肾病的重要通路，患者体内异常糖代谢发生时，PI3K/Akt信号通路刺激葡萄糖的转运，当相关蛋白表达上调时会传导至葡萄糖转运蛋白4受体分子，从而激活葡萄糖转运蛋白4，易位至细胞膜，将葡萄糖转运至细胞内。网络药理学探究发现迷迭香中的木犀草素、槲皮素、香叶木素和葫芦巴中的一些黄酮、皂苷类可抑制PI3K/Akt信号通路，减少细胞内的葡萄糖[26-28]。

4.3 “葫芦巴-迷迭香”提取物可增强血糖调节能力

II型糖尿病患者体内一般会含有大量不可逆糖基化终产物(AGEs)，高水平的AGEs会损伤胰岛 β 细胞功能，诱导其凋亡。AGE-RAGE信号通路可激活下游核转录因子(NF-KB)，抑制CASP3酶的活性，迷迭香提取物抑制胰岛β细胞的凋亡，改善胰岛β细胞的分泌功能，增加胰岛素分泌量并提高患者内源性血糖调节能力[29-30]。从“药物-活性成分-靶点”网络图中可知，迷迭香中鼠尾草酸、迷迭香酸发挥了调节血糖的能力，同时，酚酸类物质还可以抑制α-葡萄糖苷酶活性来降低葡萄糖的吸收速率[31-32]。

4.4 “葫芦巴-迷迭香”提取物可改善体内胰岛素抵抗

酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)与酪氨酸蛋白激酶一起控制参与细胞生长、代谢、分化、增殖和存活的信号通路，I型酪氨酸蛋白磷酸酶非受体(PTPN1)是一种酪氨酸磷酸酶，作为一种胰岛素信号通路负调控因子，PTPN1、PTPN2、PTPN9、PTPN11、PTPRS和DUSP9等PTPs可干扰胰岛素信号传导并触发T2DM[33]，Sun等[34]实验验证了这一可能存在的药物靶点，抑制与胰岛素抵抗相关的PTPN1，PTPN9，PTPN11和PTPRS的催化活性，减少胰岛素抵抗，从而达到降低血糖的效果。

AKT1、AKT2参与葡萄糖代谢在内的细胞过程，与糖尿病、炎症反应等多种疾病的发生密切相关。细胞因子介导的炎症反应可能引起胰岛素抵抗，研究显示IL-6、TNF在糖尿病患者体内表达显著升高，炎性因子过度表达与胰岛素抵抗程度呈正相关，导致胰岛素分泌功能障碍[35]。葫芦巴中的黄酮类化合物(葫芦巴碱、柚皮素、异荭草素等)具有抗氧化和抗炎作用，可降低IL-6和肿瘤坏死因子-α的合成及分泌，进而抑制炎性递质的产生，改善胰岛素抵抗。同时这与动物实验研究结果相符合。

综上，中药“葫芦巴-迷迭香”治疗T2DM具有可行性，作为药食同源的葫芦巴和迷迭香目前在临床上的应用研究还较少，动物实验选择了几个典型性指标进行检测，解释了“葫芦巴-迷迭香”提取物可调节血脂代谢、减少炎症反应，从而达到降糖的作用。