酶法提取草莓中白藜芦醇及其抗氧化性研究

唐 功

(阿坝师范学院 资源与环境学院 , 四川 汶川 623002)

科学研究已经证实,在草莓果实中,既含有丰富的糖类、脂肪、蛋白质、维生素等营养物质,还含有白藜芦醇等活性成分,具有增强机体抗氧化力和免疫力以及减缓皮肤衰老等保健作用。白藜芦醇是强大的抗氧化剂,是天然优良的自由基清除剂,对人类健康和预防疾病具有非常高的作用[1]。

白藜芦醇提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、超声波提取法、酶解法等[2-5]。有机溶剂提取法试剂用量大,提取效率不高,且提取法提取时间长;超声波提取和微波提取这两种方法虽然提取时间快,操作方便,但安全性和产物性质的稳定性还不能得到有效的保证;超临界CO2萃取法对原料粒度要求高,设备维护费高。因此,本实验拟采用纤维素酶解法。纤维素酶解法具有作用条件温和,不易造成污染的特点。

目前野生的白藜芦醇资源稀缺,市场的需求量很大。在我国草莓中白藜芦醇的提取工艺研究甚少,因此本实验以草莓为原料,采用纤维素酶法提取草莓中白藜芦醇。在单因素实验的基础上,借助正交试验优化草莓中白藜芦醇的最佳提取条件。通过对DPPH自由基和·OH自由基清除率的测定,评价该条件下所得草莓中白藜芦醇的抗氧化活性,以期为白藜芦醇的提取、研究和开发相关保健产品提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

草莓,汶川县水磨镇市售,烘干粉碎后备用;白藜芦醇标准品,≥98%,合肥博美生物科技有限责任公司;纤维素酶10 000 U/g,无锡高润杰科技有限公司;抗坏血酸、无水乙醇,四川西陇科学有限公司;DPPH,Scientific PHygene,含量>97.0%,上海吉至生化科技有限公司;3,5二硝基水杨酸,成都市科龙化工试剂厂;柠檬酸,天津市博迪化工有限公司。

1.2 实验仪器

UV-1800PC型紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;TDZ6B-WS台式低速自动平衡离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;JJ324BC型电子天平,常熟市双杰测试仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1原料预处理

将草莓洗净、晾干,60 ℃烘干后用高速粉碎机粉碎,过筛,得到草莓粉末,最后放置棕色瓶内保存备用。

1.3.2样品中白藜芦醇的提取

称取1.0 g草莓粉末,加入10 mL的缓冲溶液,按料液比加入一定浓度的乙醇溶液以及一定量的纤维素酶,在一定温度的恒温水浴锅内水浴数分钟后将提取液离心10 min;取1 mL上清液加乙醇溶液稀释50倍后在n=306 nm处测其吸光值,计算其提取量(mg/g)[6]。

白藜芦醇提取量=cV/m

(1)

式中：c,粗提液中白藜芦醇浓度,mg/L;V,粗提液体积,L;m,草莓粉质量,g。

1.3.3单因素实验设计

依据1.3.2的方法,考察提取剂浓度、pH值、酶添加量以及料液比对草莓中白藜芦醇提取量的影响。参数具体设置如下：提取剂浓度为40%、50%、60%、70%、80%;pH值为3、4、5、6、7;酶添加量为10、15、20、25、30 mg;料液比(g/mL)为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

1.3.4正交试验设计

为了使提取方案达到最佳的优化效果,在单因素实验的基础上,设计四因素三水平正交试验,如表1所示。

表1 正交试验设计

1.3.5DPPH自由基清除率测定

分别取不同浓度草莓白藜芦醇粗提液、Vc各2 mL,具体梯度设置为1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/L。再加入2 mL的40 mg/L DPPH溶液,摇匀,在室温黑暗环境下反应20 min;反应完成后,以Vc为对照,在n=517 nm处测其吸光值(Ai);并分别对草莓白藜芦醇粗提液、Vc设置3组平行实验,最终结果取3组平均值。无水乙醇替代粗提液,测得空白吸光度吸光度(A0),重复3次。将吸光度值带入下面公式(2)中,计算出草莓中白藜芦醇以及Vc对 DPPH 自由基的清除率。

1.3.6·OH自由基清除率测定

分别取不同浓度草莓白藜芦醇、Vc各2 mL,具体梯度设置为1.0、1.4、1.8、2.2、 2.6 mg/L,加入6 mmol/L水杨酸溶液和FeSO4溶液各2 mL,再加入0.2%H2O2溶液2 mL反应30 min。反应完成后在n=510 nm下测其吸光值(Ai),分别对草莓白藜芦醇粗提液、Vc设置3组平行实验;蒸馏水替代样品溶液,测得空白吸光度(A0),设置3组平行实验,最终结果取3组平均值。将吸光度值带入公式(2)中,计算出草莓白藜芦醇以及Vc对·OH自由基的清除率[7]。

清除率(%)=(A0-Ai)×100/A0

(2)

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1提取剂浓度对草莓中白藜芦醇提取量的影响

保持pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g/mL)不变,研究提取溶剂浓度对提取量的影响,结果见图1。

图1 提取溶剂浓度对白藜芦醇提取量的影响

由图1可知,当提取溶剂浓度在40%～60%时,提取溶剂浓度增大,白藜芦醇的提取量也不断升高,最大提取量为4.62 mg/g;此后,白藜芦醇的提取量开始下降。分析原因,可能是乙醇浓度过高对白藜芦醇的结构造成破坏。提取溶剂浓度为60%时有最大提取量,因此60%作为最适宜的提取溶剂浓度。

2.1.2pH值对草莓中白藜芦醇提取量的影响

保持提取剂浓度60%,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g /mL)不变,研究不同pH值对提取量的影响,结果见图2。

图2 pH值对白藜芦醇提取量的影响

由图2可知,当 pH值在3～5时,随着pH值的不断增大,白藜芦醇的提取量也在不断升高,当pH值=5时,最大提取量为2.47 mg/g;此后随着pH值增加,白藜芦醇的提取量下降。原因可能是pH值过高使酶的活性降低,从而影响白藜芦醇的提取量。因此pH值=5最适宜。

2.1.3酶添加量对草莓中白藜芦醇提取量的影响

控制提取剂浓度60%,pH值=5,料液比1∶40(g /mL)不变,研究酶的不同添加量对提取量的影响,结果见图3。

图3 酶添加量对白藜芦醇提取量的影响

由图3可知,当酶添加量在10～25 mg时,随着加酶量的升高,在25 mg时曲线达到峰值,最大提取量为3.93 mg/g;由于过量的酶分子不利于分子定向运动,酶活性降低,导致提取量开始回降。酶添加量为25 mg时提取量最大,因此25 mg作为最适宜的酶添加量。

2.1.4料液比对草莓中白藜芦醇提取量的影响

控制提取剂浓度60%,pH值=5,酶添加量25 mg不变,研究不同料液比对提取量的影响,结果见图4。

图4 料液比对白藜芦醇提取量的影响

由图4可知,增大料液比,提取量升高,1∶40(g/mL)时提取量最大为3.46 mg/g;此后提取量下降。若液料比适宜,则有利于白藜芦醇进入到乙醇中,使白藜芦醇充分溶解;但液料比达到一定程度后,白藜芦醇大部分已被提取剂充分溶解,继续增大液料比,就会造成溶质过少、溶剂过多的情况,草莓粉末所受的作用力就会减小,最后反而提取量减少。料液比为1∶40(g /mL)时有最大提取量,因此1∶40(g /mL)作为最适宜的料液比。

2.2 正交试验

在单因素基础上进行四因素三水平正交试验,结果如表2所示。

表2 正交试验结果表

由表2可知,四个因素对白藜芦醇提取量的影响程度依次为A>C>B>D,即提取剂浓度>酶添加量>pH值>料液比。最佳提取工艺为：

A2B2C2D2,即提取剂浓度60%,pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g/mL)。在最佳实验条件下,提取量最大,为5.23 mg/g。

2.3 抗氧化性实验

2.3.1草莓白藜芦醇DPPH自由基清除能力的测定

草莓白藜芦醇的 DPPH 自由基清除活性见图5。

图5 草莓白藜芦醇的 DPPH 自由基清除活性

由图5可知,在1.0～2.6 mg/L内,随着白藜芦醇浓度的增加,草莓中白藜芦醇对DPPH自由基的清除活性也相应增加;且草莓白藜芦醇粗提液清除活性>Vc清除活性,白藜芦醇浓度为2.6 mg/L时,对DPPH自由基清除率为77.1%。

2.3.2草莓白藜芦醇·OH自由基清除能力的测定

由图6可知,在1.0～2.6 mg/L内,随着白藜芦醇浓度的增加,草莓中白藜芦醇对·OH自由基的清除活性也相应增加;且草莓白藜芦醇粗提液清除活性>Vc清除活性,白藜芦醇浓度为2.6 mg/L时,对·OH自由基清除率为70.2%。

图6 草莓白藜芦醇的·OH自由基清除活性

3 结论

本实验采用酶法探究草莓中白藜芦醇的提取工艺,同时采用正交试验对白藜芦醇的提取工艺条件进行优化。草莓白藜芦醇提取的最佳工艺为提取剂浓度60%,pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40 (g /mL),提取量最高为5.23 mg/g。抗氧化性实验结果表明：草莓白藜芦醇对DPPH自由基和·OH自由基清除活性较强,最高清除率分别为77.1%和70.2%,表明白藜芦醇的抗氧化活性较高。