基于生物信息学分析HOXC9在神经母细胞瘤中的表达及临床应用

孙苗苗 张大△ 刘亚玲 杨洋

1)郑州大学第一附属医院小儿外科 郑州 450000;2)河南濮阳市人民医院 濮阳 457000

神经母细胞瘤 (Nuroblastoma, NB)是儿童常见的颅外实体肿瘤,占儿童肿瘤的8%～10%,90%发生于5岁以下的儿童[1]。NB起源于交感神经的神经嵴祖细胞[2],其中绝大部分发生于肾上腺髓质或腹部交感神经节,小部分发生于颈部、胸部或盆腔的交感神经节。NB具有生物学异质性,恶性度高,早期易转移[3],并具有自发消退及体外诱导分化的独特生物学特性,尤其在4 S期患儿中较易发生[4]。目前对NB的发病机制仍未完全明确。本研究应用生物信息学方法,筛选出HOXC9差异基因,并采用Q-PCR法验证其在肿瘤组织中的表达,为探讨NB的发生、发展机制和临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2021-01—2023-02在我院小儿外科行手术的28例NB、8例节神经母细胞瘤(GNB)、6例节神经细胞瘤(GN)患儿的临床资料和手术切除标本。纳入标准:初治患儿且在我院行手术治疗。病理结果经组织病理学证实。排除标准:合并其他肿瘤和免疫缺陷病患儿。未经系统治疗或失访者。本研究已经院伦理委员会审批(伦理号:2023-KY-0697),患儿家属均签署知情同意书。

1.2 方法下载TARGET数据库的NB数据及临床资料,分析NB中不同危险度间差异表达基因(differential expression genes,DEGS);富集分析差异基因参与的基因本体论(Gene ontology,GO)系统和KEGG通路,结合STRING数据库构建与基因相关的PPI关系对,采用K-M法和Log-rank检验分析PPI网络中的基因在各个样本中的表达值与预后信息之间的关系[5]。以HOXC9为目的基因,GAPDHA为内参基因,采用实时荧光定量PCR SYBR Green I方法检测肿瘤组织中HOXC9基因mRNA水平表达情况。

1.3 检测指标采用实时荧光定量PCRSYBR Green I方法检测NB、GNB、GN中HOXC9 mRNA表达水平,分析其表达水平与NB不良预后的关系。

1.4 统计学方法将GN组设为对照组,采用(2-△△Ct 法)将CT值标化后,采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。多组独立定量资料,采用Kruskal-Wallis检验;两组独立定量资料,采用Mann-Whitney检验。设定=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析根据临床数据,将样本分为高、中、低风险3组。阈值设定: P.Val<0.05 &|logFC|>1,筛选出差异表达基因,各组差异基因的数目如表1。将3组差异基因取并集,得到681个并集基因。见图1。

图1 差异基因取并集韦恩图

表1 差异基因数目统计

表2 HOXC9在 High vs Medium、High vs Low差异表达情况

将差异基因结合RNA-seq数据表达矩阵,使用Stem软件进行表达趋势聚类分析,设置clustering method: STEM Clustering Method, significance level:0.05,得到模块基因集,见图2。利用富集分析工具DAVID6.8分析差异基因参与的基因本体论(GO)系统和KEGG通路。设置显著性阈值P<0.05且富集个数(count)至少为2,可见差异基因与信号传导、神经系统发育、细胞分化显著相关。

图3 差异基因的GO和KEGG富集结果(从上到下依次是High vs Medium、 Medium vs Low、High vs Low,条形长度表示富集基因个数,颜色从蓝到红表示显著性P.Value值的减小,显著性更高)

结合STRING10.0数据库预测分析HOXC9编码蛋白之间是否存在互作关系。输入基因集为所有关键模块基因,物种为Homo Sapiens。设置参数PPI score设为0.9 (highest confidence),通过将患者按照其表达值的中位值分为高、低表达组,进行K-M生存曲线绘制,同时采用Log-rank检验值,筛选出差异基因HOXC9(P<0.05)。生存曲线如图4。

图4 HOXC9基因K-M生存曲线图

图5 HOXC9的相对表达水平注:A.HOXC9在NB、GNB、GN中的表达采用K-W检验,χ2=7.460,P=0.0240。B.HOXC9在NB+GNB、GN间的表达采用Wilcoxon秩和检验,Z=-1.348,P=0.0070。C.HOXC9在不同分期的表达采用K-W检验χ2=7.722,P=0.0521。D.HOXC9在不同危险度间的表达采用 K-W检验,χ2=12.93,P=0.0016。E.HOXC9在有无MYCN基因扩增的表达采用Wilcoxon秩和检验,Z=0.5423,P=0.020。F.HOXC9在有无骨转移之间的表达采用Wilcoxon秩和检验,Z=0.1644,P=0.3853。G.HOXC9在有无骨髓浸润之间的表达采用Wilcoxon秩和检验,Z=0.1816,P=0.99。H.HOXC9在有无淋巴结转移的表达采用Wilcoxon秩和检验,Z=0.6799,P=0.0634。I.确诊年龄(月)与HOXC9表达的散点图,简单线性回归,F=22.74,P<0.001,R2=0.3871)

2.2 Q-PCR结果HOXC9在不同病理类型的肿瘤中,GN组表达水平高,NB组的表达水平低,差异有统计学意义(P<0.05)。HOXC9在不同危险度分层中,低危组表达水平高,差异有统计学意义(P<0.05),HOXC9在有MYCN基因扩增中,有MYCN扩增组表达低(P<0.05)。HOXC9在不同分期、有无骨转移、有无骨髓浸润及有无淋巴结转移的表达差异无统计学意义(P>0.05)。绘制确诊年龄(月)与HOXC9表达的散点图,采用简单线性回归分析,回归系数检验P<0.05,回归方程成立,HOXC9表达水平=-0.01395×确诊年龄+1.399,即HOXC9表达水平与确诊年龄呈负相关。

3 讨论

HOXC9基因是发育基因,属于同源异型盒(Homebox)家族成员。在胚胎发育时期,在特定的空间位置以时间先后表达或沉默,控制胚胎结构的发育[6]。研究表明,HOXC9基因除调节胚胎发育外,也与多种恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关[7],参与细胞的增殖、分化、凋亡、神经系统发育等生理过程。

国际神经母细胞瘤分期系统(international neuroblastoma staging system,INSS)是使用最广泛的分期方法,根据确诊年龄、分期、组织病理类型、生物学特征等[8]对疾病危险程度进行分组。但小部分肿瘤可以自发消退或良性转化。自发消退是指在极少甚至无系统治疗的情况下肿瘤自行缩小乃至消失,良性转化是指肿瘤可由恶性程度高的NB转化为节GNB[9-10]。研究表明,NB自发消退可能与年龄[11]、肿瘤部位[12-13]、组织学特征[14]、分子生物学基础等因素有关。但目前NB自发消退及良性转化的调控机制尚不明确。

本研究中,HOXC9在良性GN中的表达水平高,在恶性NB中的表达水平低,在低危险度分层组的表达水平高。即,HOXC9的表达水平与肿瘤的恶性程度相关,危险度越高,恶性程度越高。HOXC9表达水平越低,细胞分化越差。据报道,HOXC9可诱导细胞分化并使NB的自我更新能力降低[15],因此HOXC9可能通过诱导神经元分化及控制细胞周期调控NB自发消退或良性转化进程。HOXC9在MYCN基因扩增组中表达低,在NB患儿中,22%的患者伴有MYCN基因扩增,或染色体1p32杂合性丢失,伴有这些基因突变的患儿预后大都较差[16-17];而MYCN基因不扩增的患儿预后较好。MYCN基因可诱导NB细胞分化,用RA治疗后NB细胞的形态学分化伴随着许多HOX基因表达的增加[18],因此HOXC9可能通过调控MYCN控制NB细胞分化。HOXC9表达水平与确诊年龄呈负线性相关,年龄越小,HOXC9表达越高,且患儿确诊年龄是NB的独立危险因素[19],年龄越大提示预后越不良。年龄是自发消退或良性转化的影响因素,与HOXC9可能诱导NB细胞分化调控自发消退或良性转化进程一致。

本研究中,HOXC9在不同分期、有无骨转移、有无骨髓浸润,以及有无淋巴结转移等病理特征中的表达差异无统计学意义,可能与样本量太少及选择偏倚有关。生物信息学分析显示,HOXC9与肿瘤神经元分化、细胞分化相关。Q-PCR分析HOXC9表达低与差的分期、高的危险度、MYCN扩增相关,提示预后不良,可能与神经母细胞瘤良性分化或自发消退有关,可为NB诊疗提供新的依据。

本研究只进行Q-PCR验证HOXC9 mRNA水平的表达,收集的临床数据时间较短,缺少生存分析。后续将进行蛋白质水平验证,进一步探索HOXC9的具体调控机制。