miR-26b-5p靶向VEGF抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

柳鑫 姜晓丽 马雪梅

肺癌作为最常见的恶性肿瘤,是导致全世界癌症患者死亡的主要病因[1]。由于癌症转移以及术后复发等因素的存在,肺癌的临床综合疗效仍不理想,晚期患者的病死率依然很高。随着高通量测序技术的发展,越来越多的证据显示微小RNA(microRNA,miRNA)可作为抑癌或者致癌因子参与肺癌的生物学进程的调控[2,3]。近年来,miR-26b-5p在多个癌种中被报道表达下调,并且miR-26b-5p的低表达与癌症的增殖、分化以及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等过程关系密切[4,5],然而其在非小细胞肺癌中的作用尚不明确。本研究通过生物信息学预测miR-26b-5p可能存在靶向结合关系的基因,过表达miR-26b-5p并分析其对NSCLC细胞生长、迁移和侵袭能力的影响,以期为非小细胞肺癌的诊治提供新思路。

资料与方法

一、实验材料与试剂

人正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞A549,购于武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养基购于美国Gibco公司,胎牛血清购于美国Hyclone公司,RNAiMAX转染试剂购于美国Invitrogen公司,Matrigel胶购于美国Corning公司,RNAiMAX转染试剂购于美国Invitrogen公司,CCK-8试剂盒和EDU试剂盒购于北京索莱宝公司,一抗购于美国Santa Cruz公司及CST公司,二抗购于美国CST公司。

二、实验方法

1. 细胞培养及转染 BEAS-2B和A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%CO2生化培养箱中传代培养,细胞融合度达85%时,30%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞进行后续实验。转染前一天将细胞消化后铺入六孔板中,24h后待细胞融合度达到60%左右时即可开始转染,分为NC- mimic组和miR-26b-5p- mimic组,按照RNAiMAX转染试剂说明书进行转染。

2. qRT-PCR检测 收集各组细胞,总RNA提取采用Trizol法,于-80℃保存。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录,然后以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列如下:miR-26b-5p:上游引物TATCTAGACATCTGCTACCTCCTCCC,下游引物ATGCGGCCGCGATTCAACAAGGACAA;U6:上游引物 TCACTTCCTATCGGATCGGC,下游引物 CTGTACCGACAAAAACACAAGC;GAPDH:上游引物TGTGGGCATCAATGGATTTGG,下游引物ACACCATGTATTCCGGGTCAAT;VEGF:上游引物GCAGAAGGAGGAGGGCAGAATC,下游引物ACACTCCAGGCCCTCGTCATT。

3. Western Blot实验 收集各组细胞,总蛋白提取采用RIPA裂解法,蛋白浓度检测采用BCA法,检测后加入5×loading buffer进行蛋白变性。变性后蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、 孵育一抗、孵育二抗、显影。采用image J软件对蛋白条带进行灰度分析,目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

4. CCK8实验 在96孔板中接种各组细胞,接种密度为每孔2000个细胞,加入培养液100uL/孔。将96孔板放置在37℃的细胞培养箱中,在细胞培养的不同时间点(1d、2d、3d),每孔分别加入10μL的CCK8试剂,孵育2h后,读取各组细胞在波长450nm处的吸光度(OD值)。记录数值并重复三次,以时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制曲线,观察细胞增殖能力的改变。

5.EDU实验:提前将细胞爬片放置于24孔板中,每孔接种3×104个细胞,培养24h;将试剂盒中的EDU工作液与完全培养基按照1 ∶1000的比例混合,每孔中加入400μL混合液,置于CO2恒温培养箱中静置2h;弃去混合液,将细胞室温下固定,每孔加入400μL 4%多聚甲醛,固定15min;弃去多聚甲醛,每孔加入400μL BSA,每次洗涤3min,共3次;弃去BSA,每孔加入400μL 0.3% Triton X-100,孵育15min;弃去0.3% Triton X-100,每孔加入400μL 3%BSA,每次洗涤3分钟,共2次;EDU检测:去除上一步的3%BSA,每孔加入已配制好的EDU检测液200μL (按照碧云天试剂盒进行配置),避光条件下孵育30min;弃去EDU检测液,每孔加入400μL 3%BSA,每次洗涤5min,共3次;细胞核染色:弃去3%BSA,每孔加入200μL 1×Hoechst染色液,避光染色10min;弃去Hoechst,每孔加入400μL 3%BSA进行洗涤,每次洗涤3分钟,共3次,取出细胞爬片,抗荧光淬灭剂封片后进行荧光拍照。

6. 细胞划痕实验 提前在6孔板背面用marker笔画线标记,当细胞长满时,用1mL无菌枪头划线,于0h和24h进行拍照并测量划痕距离。

7. Transwell小室实验 用无血清DMEM按照1 ∶9比例稀释Matrigel基质胶,取50μL加入Transwell小室内,37℃孵育2h。Transwell小室加入500μL 10%DMEM,上室加入100μL无血清的细胞悬液。培养24h后,4% 多聚甲醛固定30min,0.5%结晶紫染色15min,PBS冲洗3次,用棉签将Transwell上室细胞擦除,显微镜下观察细胞并计数。

三、统计学分析

本次研究采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行分析;定量资料用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验。所有实验至少独立重复三次,P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、 miR-26b-5p 和VEGF mRNA在BEAS-2B细胞和A549细胞中的表达情况

采用qRT-PCR检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞和人非小细胞肺癌细胞系A549细胞中miR-26b-5p和VEGF mRNA的表达水平。分析结果显示,miR-26b-5p表达水平在A549细胞中显著低于BEAS-2B细胞(t=22.08,P<0.05)(见图1A),VEGF的mRNA表达水平在A549细胞中显著高于BEAS-2B细胞(t=9.550,P<0.05)(见图1B)。

图1 miR-26b-5p 和VEGF mRNA在BEAS-2B细胞和A549细胞中的表达水平

二、 E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白在BEAS-2B细胞和A549细胞中的表达情况

采用Western Blot检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞和人非小细胞肺癌细胞系A549 VEGF细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。分析结果显示,E-cadherin蛋白的表达水平在A549细胞中显著低于BEAS-2B细胞(t=4.434,P<0.05),而Vimentin蛋白表达水平和VEGF的蛋白表达水平在A549细胞中显著高于BEAS-2B细胞(t=3.744,P<0.05;t=3.744,P<0.05)(见图2)。

图2 E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白在BEAS-2B细胞和A549细胞中的表达水平

三、VEGF为miR-26b-5p的预测靶点

通过生物信息学预测平台RNAInter预测并发现VEGF与miR-26b-5p可能存在靶向结合关系,且结合评分很高(Confidence Score=0.8808)(如图3所示)。

图3 miR-26b-5p/VEGF靶向预测结合位点及评分(RNAInter)

四、构建miR-26b-5p过表达细胞模型

用NC-mimic 和miR-26b-5p-mimic转染A549细胞48h,用qPCR验证转染效率。结果显示,miR-26b-5p-mimic组中miR-26b-5p表达水平显著高于NC-mimic组(t=12.24,P<0.05)(如图4所示)。结果证明miR-26b-5p过表达细胞模型构建成功。

图4 qPCR检测A549细胞miR-26b-5p的过表达效率

五、miR-26b-5p对A549细胞的增殖活力的影响

CCK-8结果显示,在24h、48h以及72h时,miR-26b-5p-mimic组吸光值显著低于NC- mimic组(t=4.491,P<0.05;t=3.802,P<0.05;t=6.737,P<0.05)(如图5所示)。提示miR-26b-5p可有效抑制A549细胞的增殖活力。

图5 CCK8检测过表达miR-26b-5p对A549细胞增殖活力的影响

六、miR-26b-5p对A549细胞的DNA合成能力的影响

EDU结果显示,miR-26b-5p-mimic组细胞核中绿色荧光明显少于NC- mimic组,表明miR-26b-5p-mimic组的DNA合成能力低于NC- mimic组(如图6所示)。

图6 EDU检测过表达miR-26b-5p对A549细胞DNA合成能力的影响(×100)

七、miR-26b-5p对A549细胞的迁移能力的影响

划痕实验结果显示,miR-26b-5p-mimic组在24h划痕距离显著高于NC-mimic组(t=10.00,P<0.05)(如图7所示),提示A549细胞迁移能力受到抑制。

图7 划痕实验检测过表达miR-26b-5p对A549细胞迁移能力的影响

八、miR-26b-5p可有效抑制A549细胞的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示, miR-26b-5p-mimic组侵袭细胞数(200±18.4)显著低于NC-mimic组(323.7±50)(P<0.05)(如图8)所示,提示A549细胞的侵袭能力受到抑制。

图8 Transwell侵袭实验检测过表达miR-26b-5p对A549细胞侵袭能力的影响

九、miR-26b-5p对靶向VEGF对上皮间充质转化相关蛋白的影响

WB结果显示,miR-26b-5p-mimic组E-cadherin蛋白表达显著高于NC-mimic组(t=3.640,P<0.05),而Vimentin蛋白和VEGF蛋白的表达显著低于NC-mimic组(t=6.545,P<0.05;t=18.45,P<0.05)(如图9所示)。

图9 Western Blot实验检测过表达miR-26b-5p对E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白表达水平的影响

讨 论

2020年世卫组织公布的全球癌症统计分析数据显示,肺癌以11.4%的确诊率位列新发癌症的第二位,以18%的死亡率成为癌症患者最主要死因[6]。肺癌根据组织病理学可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC),其中NSCLC的患者占比高达85%[7]。现阶段对于NSCLC的研究已经取得了一定的进展,但鉴于癌症转移以及术后复发等因素的存在,NSCLC的临床综合疗效仍不理想,晚期患者的病死率依然很高。因此深入研究NSCLC的发病机制,在分子水平上探索敏感且特异的有助于NSCLC早期诊断、治疗以及评估预后的生物标志物迫在眉睫。

miRNA是长度在20-24个核苷酸非编码单链小分子RNA,其在细胞增殖、分化以及凋亡等多个进程中发挥着重要的调节作用[8-10]。越来越多的研究表明,miRNA的异常表达与NSCLC的发生发展密切相关。近年来,miR-26b-5p在结直肠癌[11]、甲状腺癌[12]、膀胱癌[13]、肝细胞癌[14]等多个癌种中被报道表达下调,并且miR-26b-5p的低表达与癌症的增殖、分化以及EMT等过程关系密切。例如,miR-26b-5p在多发性骨髓瘤中通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡发挥抑瘤作用[15]。也有报道称,miR-26b-5p对肺腺癌细胞的细胞增殖具有抑制作用[16]。我们的研究表明,miR-26b-5p表达水平在NSCLC细胞系A549细胞中低表达。进一步生物学功能的实验表明miR-26b-5p能够抑制A549细胞的生长、迁移和侵袭,与以往的研究结论相一致。

癌细胞的增殖和转移是导致肺癌治疗失败的主要因素[17]。与肺癌增殖转移的相关的分子包括转化生长因子-β(TGF-β)、microRNA-126和VEGF等,它们都可以进入血液系统参与调控癌细胞的增殖转移[18]。VEGF是促进血管新生的主要因子,可以通过阻断VEGF信号通路来抑制肿瘤生长[19]。Grun等[20]人成功分离出表皮肿瘤干细胞,其具有生长速度快、侵袭性高以及血管化高等特性,VEGF是其维持这种表型的关键因子,应用VEGF抑制剂或者沉默VEGF的表达都可以抑制其特性。还有研究显示蜂毒素能够通过调控VEGF信号通路下调组织蛋白酶-S来发挥抑制人肝癌细胞系MHCC97-H的细胞增殖、侵袭以及血管生成能力[21]。VEGF在多种肿瘤细胞中表达上调,预示其过表达与肿瘤进展有关,并且VEGF高表达已经确定为肺癌患者预后不良的独立危险因素[22]。研究显示,E-cadherin是一种细胞黏附分子,在细胞间连接和肿瘤细胞转移过程中发挥关键作用[23],下调E-cadherin的表达会打破细胞间的连接,增加肿瘤细胞的侵袭和转移能力[24]。Vimentin是上皮-间质转化的标志性蛋白,其上调参与了肿瘤的浸润和转移[25]。我们的研究表明,在NSCLC细胞系A549细胞中,miR-26b-5p和VEGF存在靶向关系,其能够负向调控VEGF的表达,进一步研究发现miR-26b-5p可以通过靶向VEGF抑制细胞的迁移和侵袭,并且降低Vimentin蛋白的表达。

综上所述,miR-26b-5p在NSCLC细胞系A549细胞中低表达,miR-26b-5p 可通过靶向调控VEGF的表达抑制NSCLC肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭,从而参与NSCLC的发生、发展。既往研究发现VEGF已有靶向药物应用,如贝伐珠单抗,本研究证明了miR-26b-5p与VEGF的靶向关系以及其在NSCLC中的作用,提示miR-26b-5p也有望成为NSCLC治疗的潜在靶点,这有助于评估NSCLC患者的治疗反应和预后,也为NSCLC的个体化靶向治疗提供新的思路。但今后还需要扩大样本量,深入研究miR-26b-5p与VEGF信号通路的作用机制,以及miR-26b-5p自身的上游调控因子,为开发miR-26b-5p、VEGF相关的NSCLC新靶向治疗提供更多实验依据。