肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物/成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14轴及下游核因子κB通路的关键因子mRNA及蛋白表达差异与老年肥胖的相关性

赵艳姣,卓娅·买买提乌斯满,刘金玲,王红梅

(新疆维吾尔自治区人民医院综合保健内科二病区,乌鲁木齐 830000)

肥胖是由能量摄入较高或体力活动较少等因素引起的体内能量正平衡,是多种慢性病的严重危险因素。Yamada等[1]发现老年人群中心血管疾病、高脂血症和糖尿病的患病率随体质量指数(body mass idex,BMI)增加而增加,且肥胖组的值相对较大。老年肥胖的并发症较多,严重危害身体健康。肥胖的病因涉及多方面,包括由促炎细胞因子水平升高介导的低度慢性炎症状态,与脂肪组织产生并释放各种促炎和抗炎因子有关,如脂肪因子瘦素、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等细胞因子[2]。肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)属于肿瘤坏死因子超家族促炎细胞因子,被认为与多种疾病相关,TWEAK/成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14,Fn14)轴也可能参与肥胖的炎症失衡。

TWEAK与Fn14结合可激活下游信号通路,如核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路,这些通路涉及细胞增殖和分化[3]。众所周知,NF-κB信号通路是多种疾病炎症的核心调节因子。虽然TWEAK/Fn14轴和NF-κB通路分别被证实在肥胖的发病中具有重要地位,但二者在肥胖发生中的相互作用尚缺乏依据。本研究通过病例-对照研究来分析TWEAK/Fn14轴及激活NF-κB通路的关键因子表达差异与老年人中心性肥胖的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2017年9月至2018年5月在新疆农牧区常住居民中采用多级随机抽样方法进行流行病学调查,共2100名居民参与,其中不配合222名,数据不完整40名,最终完成调查居民1838名。其中中心性肥胖836名,无肥胖1002名,按照1∶1比例由计算机随机生成的数字分为中心性肥胖组(n=40)和无肥胖组(n=40)。调查时,由经过统一培训的专职人员收集性别、年龄、身高、体质量指数、腰围、收缩压、舒张压、民族、学历、婚育史等信息。本研究经新疆自治区人民医院医学伦理委员会认定符合医学伦理(伦理审查号:KY2021031027),所有参与者签署知情同意书。

中心性肥胖的诊断标准:根据《中国居民肥胖防治专家共识》[4],无肥胖为男性腰围<90cm、女性腰围<85cm;中心性肥胖为男性腰围≥90cm、女性腰围≥85cm。

纳入标准:年龄≥60岁;能独立行走,未使用辅具。排除标准:认知障碍;言语障碍;精神疾病;疾病急性发作期;重要器官功能衰竭;近期手术史;服用激素类药物;感染性疾病;恶性肿瘤及肺结核等消耗性疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及检测指标 每位研究对象采集空腹静脉血至少5ml,放入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管中,轻轻颠倒8～10次,充分混匀;立即进行梯度离心,分离血清与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),血清样本测定血清谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、肌酐(creatinine,Cr)、总胆固醇(total cholesterol,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。将分离好的PBMC添加1ml Trizol试剂,储存于-80℃冰箱,待实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测mRNA表达;另外一部分PBMC直接储存于-80℃冰箱,用于Western blotting检测蛋白表达。

1.2.2 PCR检测 采用PCR检测PBMC中TWEAK、Fn14、IκB激酶-α(inhibitor of kappa B kinase-α,IKKα)、IκB激酶-β(inhibitor of kappa B kinase-β,IKKβ)、NF-κBp65的mRNA表达。使用primer5软件设计TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65基因引物序列,详见表1;反应体系包括Evagreen 2×qPCR master mix 10μl、上游引物0.6μl、下游引物0.6μl、cDNA 2μl、RNase-free water6.8μl,总反应体积为20μl。PCR条件:预变性95℃ 10min、1个循环,变性95℃ 15s,退火/延伸60℃ 60s,共40个循环。通过SYBR法进行荧光定量检测,采用2-△△ct的方法计算基因的相对表达量。

表1 荧光定量mRNA检测引物信息

表2 中心性肥胖组及对照组临床资料比较

1.2.3 Western blotting 采用Western blotting检测TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达情况。将细胞样本经胰酶消化后,加300μl裂解液充分混匀。4℃放置1h,12000转/min,4℃,离心15min,收集上清。80V恒压使溴酚蓝至分离胶处,恒压100V,90min。十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳结束,将聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜在甲醇中浸泡10s,蒸馏水中漂洗1min,然后将聚丙烯酰胺凝胶、滤纸及处理过的PVDF膜在Transfer buffer中浸泡10min,制备转膜“三明治”。转膜后将PVDF膜水洗3次,10min/次。用含5%脱脂奶粉封闭液封闭转印膜1h,然后TBST洗3次,10min/次。随后进行一抗和二抗的孵育。将显色液混合,加2ml至膜上,化学发光仪检测、拍照。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组临床特征比较

两组间年龄、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)及性别构成差异有统计学意义(P<0.05);但收缩压(systolic blood pressure,SBP)、生化指标、民族、文化程度、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、冠心病构成差异均无统计学意义(P>0.05;表3)。

2.2 两组外周血PBMC各基因mRNA含量比较

中心性肥胖组外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ基因mRNA含量高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05);中心性肥胖组TWEAK及NF-κBp65基因mRNA含量也高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05;表4)。

表4 外周血PBMC中基因mRNA表达水平分析

2.3 两组外周血PBMC各因子的蛋白表达水平比较

与对照组相比,中心性肥胖组外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ蛋白表达水平升高,且差异有统计学意义(P<0.05);两组间TWEAK、NF-κBp65差异无统计学意义(P>0.05;表5,图1)。

图1 Western blotting 检测各蛋白表达Figure 1 Protein expression band diagram TWEAK: tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis; Fn14: fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14; IKKα: inhibitor of kappa B kinase-α; IKKβ: inhibitor of kappa B kinase-β; NF-κBp65: nuclear factor-kappa-B p65.

表5 血清分离PBMC中各蛋白表达水平分析

2.4 TWEAK/Fn14及各基因间双变量Pearson相关性分析

外周血PBMC中TWEAK与Fn14的mRNA水平呈正相关(P<0.01),与IKKα、IKKβ水平无相关性;而Fn14的mRNA水平与IKKα、IKKβ的水平均呈正相关(P<0.05);IKKα、IKKβ的mRNA水平与NF-κBp65的水平也均呈正相关(P<0.01;表6)。

表6 外周血PBMC中各基因mRNA含量相关性分析

3 讨 论

肥胖会引起老年人多器官免疫系统的改变,使脂肪组织、肝脏、胰岛等呈低度慢性炎症[5]。实际上肥胖与脂肪组织升高有关,脂肪组织生长可能是每个成熟脂肪细胞的脂质负荷增加或数量增多,亦或是两者兼有。脂肪组织除储存能量外,也是一种内分泌细胞,会产生多种炎症分子,称为脂肪细胞因子,如TNF-α、IL-6、瘦素等[6],因促炎因子升高导致体内长期处于低度慢性炎症状态。

TWEAK是TNF超家族的Ⅱ型膜蛋白,其膜结合形式(a membrane anchored form,mTWEAK)和可溶性变体(a cleaved soluble form,sTWEAK)都有生物活性,均可结合受体Fn14,进而控制许多生物活动[7]。Fn14是TWEAK的特异性受体,在细胞外结构域与TWEAK相互作用,通过肿瘤坏死因子受体相关因子结合位点与该因子家族蛋白相结合而传导TWEAK信号。TWEAK在成人组织中广泛表达,如单核细胞、骨骼肌和脂肪细胞等。研究表明在肥胖者的皮下和内脏脂肪组织中TWEAK及Fn14的水平升高[8],但也有研究表明[9]TWEAK和相应的激动性抗体具有防止脂肪组织生长的潜力。Ponce-de-Leon等[10]发现皮下或内脏脂肪与TWEAK呈负相关。本研究提示中心性肥胖组人外周血PBMC中的Fn14基因mRNA含量及蛋白表达水平明显高于对照组,且差异有统计学意义;而中心性肥胖组TWEAK基因mRNA含量及蛋白表达水平虽高于对照组,但差异无统计学意义。Fn14作为TWEAK的受体,在本研究中二者呈正相关(r=0.472,P<0.01)。Gomez-Martin等[11]在肥胖者中检测到sTWEAK水平降低,其原因有两种可能:一种是在炎症因子刺激下Fn14表达增加,从而增加了sTWEAK的可用性,这可能导致血清sTWEAK的外周减少[12];另一种假设提出了分化簇163(cluster of diffe-rentiation 163,CD163)的参与,CD163是一种单核细胞-巨噬细胞表面受体,已被认为是sTWEAK的清道夫受体。可溶性CD163(a soluble form CD163,sCD163)是一种巨噬细胞特异性血清标志物,炎症条件下升高,在体外可促进sTWEAK降解[13]。因此,sTWEAK的减少可能与sCD163的存在有关。本研究中老年中心性肥胖组与对照组之间TWEAK表达差异无统计学意义可能与sTWEAK的减少有关。

TWEAK与Fn14结合已被证明可激活多种细胞内信号通路,包括NF-κB通路。NF-κB是一种普遍存在的转录因子,与增殖、分化、凋亡、炎症等相关。活化的NF-κB可促进大多数炎症细胞因子分泌[14]。NF-κB作为二聚体发挥作用,在细胞中最常见形式是p50/p65和p50/p50,其次是p50/c-Rel和p52/RelB,取决于细胞类型和激活刺激物。NF-κB通路是通过IKK复合物激活的,该复合物主要由两个催化亚基IKKα、IKKβ和一个寡聚调节亚基IκB激酶-γ(inhibitor of kappa B kinase-γ,IKKγ)组成[15]。在生理条件下,NF-κB位于细胞质中,与抑制剂IκB结合而无活性。据报道IKK-β是多种促炎因子激活NF-κB通路的必要亚基。在刺激先天免疫受体(如Toll样受体)或细胞因子受体(如Fn14受体)后,IKKβ被激活并磷酸化IκB蛋白,导致IκB失活后与NF-κB解离,诱导NF-κB从细胞质转移到细胞核,进而激活基因转录[16],此为NF-κB经典途径激活。相比之下,替代途径需激活上游NF-κB诱导激酶(NIK或MAP3K14)和IKKα,并将p100亚基蛋白水解加工成p52[17]。研究证实通过IKK抑制剂可下调脂肪组织中IKK/NF-κB通路,以减弱肥胖的慢性炎症状态[18]。Romo等[19]发现肥胖释放的细胞外基质可使IKKα、IKKβ的mRNA和蛋白质水平增加,并激活NF-κB通路发挥促炎作用。然而Tsaousidou等[20]证明表达刺豚鼠相关肽的神经元中的IKK2激活不会导致肥胖。本研究发现,与对照组相比,中心性肥胖组PBMC中IKKα、IKKβ基因mRNA含量及蛋白表达水平明显升高(P<0.05);Fn14的mRNA水平与IKKα、IKKβ的水平均呈正相关(r=0.262、0.275;P<0.05);IKKα、IKKβ与NF-κBp65基因mRNA含量呈正相关(r=0.747、0.692;P<0.01);提示TWEAK/Fn14可能与NF-κB激活相关。考虑到NF-κB转录因子广泛分布于不同类型的细胞中,发挥作用的二聚体类型较多,且具体取决于细胞类型和激活刺激物,故该研究NF-κBp65蛋白表达水平减低可能与脂肪细胞中的表达较其他细胞(如骨骼肌细胞、肝细胞等)较低相关,但仍需进一步验证。

综上,本研究通过探讨TWEAK/Fn14及激活下游NF-κB通路的关键炎症因子表达与老年中心性肥胖的关系,发现新疆农牧区常驻老年人中心性肥胖与外周血PBMC中Fn14、IKKα、IKKβ的蛋白、mRNA的高表达相关,TWEAK/Fn14可能通过调节IKK激活NF-κB通路,参与老年中心性肥胖的进展。但该研究为横断面研究,只能探究其相关性,且样本量较少,未来需扩大样本量进一步开展前瞻性研究进行验证,并开展细胞及动物实验研究相关机制。