柱层析提取黑果腺肋花楸原花青素、维生素C及体外活性研究

刘君宇，王晓林，钟方丽，陈 浩

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022）

0 引言

黑果腺肋花楸（简称黑果），又称野樱莓［1］，原产于北美、北欧地区，生长于湿树林和沼泽地带［2］，其含有丰富的花青素、维生素等多种活性物质，对人体抗肿瘤、抗氧化、抗衰老具有显著功效［3］.随着社会的飞速发展，人类生活质量不断提高，日益重视身体健康状态，标志着天然产物具有非常广泛的发展前景［4］.黑果作为营养丰富的优等经济林作物，对天然保健食品的研究和开发具有重要意义［5］.

原花青素具有特殊的分子结构，主要由不同数量的表儿茶素和儿茶素构成，可以有效提高维生素C 的吸收率，对抗氧化及抑制DNA 损伤有出奇的效能［6］.可通过有机溶剂提取［7］、微波辅助提取［8］、超声波提取［9］等方法提取黑果中原花青素，其果实中所富含的活性成分可有效防治心血管疾病、防止机体氧化，此类经济林作物在医药、保健食品等领域［10］已广泛应用.本研究采用柱层析循环联合法对黑果中原花青素及维生素C进行联合提取，探究其最佳提取工艺，追求消耗更少提取溶剂，得到更高提取效率，为黑果系列研究提供数据参考.

1 试验材料与仪器

1.1 主要试验材料

黑果（吉林省黑果花楸农业科技开发公司）；儿茶素标准品（上海宝曼生物科技有限公司）；抗坏血酸标准品、氨基苯磺酸（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）；盐酸萘乙二胺（分析纯，上海化学试剂有限公司）；黄嘌呤氧化酶（上海宝曼生物科技有限公司）；甲醇、无水乙醇（分析纯，天津大茂化学试剂有限公司）.

1.2 主要仪器与设备

TU-1950 型紫外-可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；CHA-S 型数显恒温振荡器（金坛华城开元试验仪器厂）；H1850型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；RE-52C型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；XMTD-8222型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）.

2 试验方法

2.1 维生素C质量标准曲线的绘制

抗坏血酸接触空气易氧化，但在酸性环境中稍慢，为减缓其氧化速度，用较稳定的2 %的偏磷酸溶液将0.05 g抗坏血酸溶解于500 mL容量瓶中，蒸馏水定容，充分摇匀后即可得到维生素C 对照品溶液（100 μg/mL），吸取维生素C 对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL容量瓶中，蒸馏水定容，紫外可见分光光度仪在246 nm处测其吸光度值，绘制标准曲线为：

其中，y为被测物吸光度值，x为维生素C的质量浓度（μg/mL）.

2.2 原花青素质量标准曲线的绘制

用甲醇将10 mg 儿茶素溶解与10 mL 容量瓶中，甲醇定容，充分摇匀后即可得儿茶素对照品溶液（1 mg/mL）.吸取儿茶素对照品溶液0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL 于10 mL 容量瓶中，甲醇定容.取盐酸与正丁醇（体积比为5：95）的混合溶液6.0 mL到锥形瓶中，加不同浓度的儿茶素对照品溶液1.0 mL、2 %硫酸铁铵溶液0.2 mL，沸水浴回流反应40 min，立即冷却至室温，紫外可见分光光度仪在546 nm处测吸光度值，绘制标准曲线为：

其中，y为被测物吸光度值，x为原花青素的质量浓度（mg/mL）.

2.3 样品上柱前工艺参数的确定

2.3.1 最佳提取溶剂的确定 取1.0 g的黑果果粉6份，以10 mL不同体积比乙醇水溶液为提取溶剂，200 r/min 条件下室温摇床振荡1 h，6 000 r/min 条件下低温离心10 min，即得供试品溶液，按2.1和2.2的方法测定原花青素与维生素C的质量浓度，确定黑果不同活性成分的最佳提取溶剂.

2.3.2 吸涨率的确定 称取1.0 g黑果粉末12份，6份一组，分别加入10 mL原花青素或维生素C 的提取溶剂，200 r/min 条件下室温摇床振荡0.5、1、2、3、4、5 h，分别按时取出，6 000 r/min 条件下低温离心10 min，测定各份上清液体积，计算黑果原花青素、维生素C的吸涨率.

2.3.3 浸泡平衡时间的确定 分别测定2.3.2上清液中原花青素、维生素C的含量，以确定原花青素、维生素C在相应溶剂中溶解达到平衡时的浸泡时间.

2.4 柱层析分别提取黑果原花青素与维生素C

称取黑果粉末5.0 g，湿样上柱到直径为2.0 cm 的玻璃层析柱中，充分混匀，保持乙醇溶液没过样品，保持室温条件下静置至浸泡平衡时间，确定的黑果的吸涨总体积为一个收集单位，控制流速为0.4 mL/min，收集3份洗脱液，剩余残渣超声提取1 h后抽滤，得残渣超声提取液，测定洗脱液和提取液中原花青素的质量浓度.

同样方法，纯水上样，与洗脱原花青素不同的是，洗脱维生素C时层析柱需黑布包裹避光，收集3份水洗脱液和1份残渣超声提取液，测定洗脱液和提取液中维生素C的质量浓度.

2.5 柱层析循环联合提取黑果原花青素与维生素C

黑果原花青素、维生素C 的提取连续进行，方法与2.4 单独提取方法相同，选取4 根直径为2.0 cm的玻璃层析柱，称取黑果粉末5.0 g，共4份，湿样上柱，收集洗脱液，在原花青素收集最后一份时，更换为维生素C的提取溶剂纯水，继续收集洗脱液，各洗脱液的最后一份，作为下一根层析柱的第一份洗脱液，从第二根柱开始，不浸泡至平衡时间，如此循环，测定各洗脱液中原花青素与维生素C的质量.分别合并原花青素与维生素C的洗脱液，浓缩，制成干浸膏.

2.6 黑果提取物的体外活性研究

2.6.1 黑果提取物对黄嘌呤氧化酶抑制能力的测定 参考文献［11］的方法，向酶促反应体系中加入0.2 mL 浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 黑果原花青素或维生素C 供试液.用紫外分光光度计测定加入黑果供试液前后样品的吸光度值.通过式（3）计算提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率，由此可知从黑果中提取的原花青素、维生素C对黄嘌呤氧化酶抑制能力.

其中，C为黑果提取物对黄嘌呤氧化酶抑制率（%），A样加入供试液时样品吸光度，A空为无供试液对照组吸光度.

2.6.2 黑果提取物总抗氧化能力的测定 取2.13 g 磷酸钠、0.99 g 钼酸铵、6.67 mL 硫酸溶于200 mL 水中，混匀，即钼酸铵反应体系.按0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的浓度梯度配制维生素C对照品溶液，取0.5 mL各浓度的对照品溶液，分别加入到5.0 mL钼酸铵反应体系中，95 ℃水浴反应90 min 后，立即冷却至室温，紫外可见分光光度仪在695 nm 处测定吸光度值.以对照品溶液浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线.将干浸膏溶解并且配制成浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的原花青素或维生素C 样品溶液，取不同浓度的样品溶液 0.5 mL，加入5 mL 钼酸铵反应体系，95 ℃水浴反应90 min后，快速冷却至室温，紫外可见分光光度仪在695 nm 处测定吸光度.被测物的总抗氧化能力以相当于多少浓度的维生素C来表示.

2.6.3 黑果提取物清除亚硝酸盐能力的测定 将干浸膏溶解并稀释，配制成浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL原花青素供试品溶液或浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的维生素C供试品溶液，向试管中分别加入不同浓度的供试品溶液1.0 mL、10 μg/mL 的NaNO2溶液2.5 mL、由1.0 g NaCl 加蒸馏水溶解定容到500 mL 容量瓶，加少量浓HCl 调pH 至3.0 的模拟胃酸7.5 mL，37 ℃水浴反应30 min 后，迅速加入0.4 %对氨基苯磺酸溶液0.5 mL，静置反应15 min，依次加入0.2 %盐酸萘乙二胺溶液0.25 mL、蒸馏水7.0 mL，继续静置反应15 min.紫外可见分光光度仪在538 nm处测吸光度值.

将维生素C 对照品配置成浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的对照品溶液，于538 nm 处测得吸光度值.通过式（4）计算黑果提取物对亚硝酸盐的清除率.以维生素C 对照品溶液和供试品溶液的清除率为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线.分别计算维生素C对照品溶液和供试品溶液的IC50值.

其中，W为黑果提取物对亚硝酸盐的清除率（%），A样品为加入样品溶液的吸光度，A空白为不加样品溶液对照组吸光度，A对照为样品溶液的本底值.

3 结果与讨论

3.1 样品上柱前工艺参数确定的试验结果

3.1.1 最佳提取溶剂确定的试验结果 如图1 所示，分别以40 %乙醇水溶液和纯水作为黑果原花青素和维生素C的最佳提取溶剂，提取液中原花青素和维生素C的质量分别达到最大值61.17、50.59 mg.

图1 溶剂浓度的确定Fig.1 Determination of solvent concentration

图2 吸涨率的确定Fig.2 Determination of suction rate

图3 浸泡平衡时间的确定Fig.3 Determination of immersion equilibrium time

3.1.2 吸涨率确定的试验结果 如图 2 所示，黑果对40%乙醇水溶液和纯水具有不同的吸收量，原花青素与维生素 C 的吸涨率分别为2.6、3.2 mL/g.故提取原花青素和维生素C 时，分别以2.6倍、3.2倍的果肉质量收集提取液.

3.1.3 浸泡平衡时间确定的试验结果 如图 3 所示，黑果提取液中原花青素与维生素C 的质量随浸泡时间的延长逐渐增大，而浸泡时间分别达到3 h和2 h 后，两种活性成分的质量基本保持不变，以此为参考，即黑果原花青素与维生素 C 的浸泡平衡时间为分别为3 h 和2 h；两种活性成分以柱层析法同时提时，选择较长浸泡时间3 h效果更好.

3.2 柱层析分别提取黑果原花青素和维生素C的试验结果

分别测定3 份洗脱液及1 份残渣超声提取液中原花青素、维生素C 的质量，其总和视为100%，当洗脱液中相应的组分达到总量的95%以上时，视为完全提取，试验结果见图4.前3 份洗脱液及1份残渣超声提取液中原花青素和维生素C的总量分别为150.95、10.66 mg，且前2份洗脱液分别达到总量的95.81%、95.58%，总含量均大于95%.而第3份洗脱液含量较低，故只收集前2份洗脱液，第3份洗脱液作为下一根层析柱的提取溶剂.

图4 分别提取原花青素和维生素C的试验结果Fig.4 Experimental results of extracting anthocyanins and vitamin C separately

3.3 柱层析循环联合提取黑果原花青素和维生素C

如图5 所示，循环联合提取黑果原花青素及维生素C 时，原花青素的前3 轮提取率分别为86.06%、88.56%、94.08%，第4 轮提取率高达99.31%.维生素C 前3 轮提取率分别为89.51%、90.71%、94.73%、第4轮提取率高达98.62%.结果表明，以此方法进行循环提取可用少量溶剂而得到较高浓度的洗脱液，大幅度增加生产效率.

图5 循环联合提取原花青素、维生素C的试验结果Fig.5 Experimental results of proanthocyanidins and vitamin C by combined cycle

3.4 体外活性研究的试验结果

3.4.1 抑制黄嘌呤氧化酶能力的试验结果 如图6 所示，以黑果原花青素、维生素C 供试液浓度为横坐标，对黄嘌呤氧化酶抑制率为纵坐标，分别进行线性拟合：y=3.918x+30.496，R2=0.879 6，IC50值为4.978 mg/mL；y=4.106x+20.486，R2=0.999 6，IC50值为7.188 mg/mL.由试验数据可知，随着加入供试液中原花青素、维生素C 浓度的增大，对黄嘌呤氧化酶的抑制率随之增高，且原花青素提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制能力强于维生素C提取物.

图6 黑果提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of xanthine oxidase by Aronia melanocarpa extract

3.4.2 总抗氧化能力测定的试验结果 对维生素C对照品的抗氧化能力进行线性拟合：y=2.415 8x-0.043 8，R2=0.996 8.用黑果原花青素及维生素C提取物配制供试品溶液，测得其吸光度值，并代入标准曲线方程，如图7所示，以相同吸光度值的维生素C对照品当量浓度来表示两种提取物的抗氧化活性.当原花青素供试液浓度为2.41 mg/mL，维生素C供试液浓度为2.90 mg/mL，维生素C对照品溶液的当量浓度为0.3 mg/mL.说明黑果提取物具有一定的抗氧化能力.

图7 黑果提取物总抗氧化能力测定的试验结果Fig.7 Experimental results for determination of total antioxidant capacity of Aronia melanocarpa extract

3.4.3 清除亚硝酸盐能力的试验结果 如图8 所示，两种提取物原花青素、维生素C 的浓度越大，其清除亚硝酸盐能力越强.原花青素、维生素C 提取物与对亚硝酸盐清除率的线性拟合方程分别为：y=391.42x-26.398，R2=0.933 0，IC50值为0.195 mg/mL；y=111.06x+1.57，R2=0.986 2，IC50值为0.436 mg/mL.维生素C 对照品与对亚硝酸盐的清除率线性拟合方程为：y=924.42x+3.97，R2=0.992 3，IC50值为0.047 mg/mL.结果表明原花青素提取物清除亚硝酸盐的能力强于维生素C提取物，但两种提取物对亚硝酸盐的清除能力均弱于对照品维生素C.

图8 黑果提取物清除亚硝酸盐的试验结果Fig.8 Experimental results of scevenging nitrite by Aronia melanocarpa extract

4 结论

在提取溶剂分别为40%乙醇水溶液和纯水，吸涨率分别为2.6 mL/g和3.2 mL/g，浸泡平衡时间分别为3 h 和2 h 的条件下，经柱层析循环联合提取后黑果原花青素及维生素C 的提取率均可达到95%以上.通过柱层析循环联合法提取活性物质，可克服只提取一种物质的缺陷，且提取条件简单，不破坏天然产物中的热敏物质，原料消耗少，达到低耗高效的目的.

体外活性试验表明，黑果原花青素及维生素C提取物均具有抑制高尿酸血症、抗肿瘤能力和一定的抗氧化活性.以柱层析循环联合法探究提取黑果原花青素及维生素C 的最佳工艺条件，从而进行活性成分的高效提取，可应用于研制具有抗衰老、抗肿瘤、降尿酸功能的辅助医疗产品.试验结果为黑果这种经济林作物的进一步研究开发与应用提供数据参考.