血清和玻璃体中miR-126和miR-325与增生性玻璃体视网膜病变严重程度的关系

唐 辛,刘志明,徐宁达,李佳睿,黄旅珍

0 引言

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是指患者孔源性视网膜脱离(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)后出现的炎症性眼病,也是致盲的主要原因[1]。其临床特征主要为玻璃体混浊、出现棕色颗粒、视网膜组织僵硬且有褶皱等[2]。临床只能通过手术干预治疗,尚无特效治疗PVR手段[3]。因此,寻求新的生物标志物为PVR的诊治研究提供新的研究方向十分必要。微小RNA(miRNA)在各种生物学过程中发挥关键作用,如细胞免疫、增殖、分化、血管生成等[4]。除血清、眼泪、母乳等常规体液外,最近在玻璃体中也发现了miRNA[5]。据报道,一些miRNA与玻璃体视网膜疾病的进展关系较为紧密[6]。miR-126、miR-325在缓解炎症和促进血管的形成中发挥重要作用,但其在PVR发生发展中的作用研究较少[7-9]。本研究通过检测PVR患者血清和玻璃体中miR-126、miR-325的表达情况,旨在探讨miR-126、miR-325与PVR严重程度的关系。

1 对象和方法

1.1对象回顾性研究。选取2019-10/2022-10在本院治疗的PVR患者100例100眼。纳入标准:(1)确诊为PVR患者[10];(2)均接受标准的平坦部玻璃体切除术;(3)自愿参与本研究;(4)无认知障碍,能自主交流并主动配合医生的检查。排除标准:(1)双眼病变患者;(2)孕妇、哺乳期的妇女;(3)合并青光眼、白内障、先天性弱视者;(4)患有高血压、系统性红斑狼疮、恶性肿瘤等疾病。按照视网膜病变程度分级[9],分为A(玻璃体内有云雾状或色素性颗粒中混浊)、B(视网膜内面出现皱褶和视网膜裂孔有卷边,视网膜血管明显迂曲)、C(视网膜脱离处,出现全层固定皱褶)、D(整个眼底有视网膜全层固定皱褶,皱褶以视乳头为中心形成漏斗状,漏斗的尖端朝向视乳头)。A/B为轻度组42眼,C/D为重度组58眼。选取同期因眼外伤在本院进行玻璃体切除术无视网膜病变的患者30例30眼为对照组。本研究通过医院伦理委员会批准,所有参与者均知情同意。

1.2方法所有患者术前抽取静脉血,4 ℃自然凝固后离心分离血清,玻璃体液在手术室完成采集。使用TRIzol总RNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度,使OD260/OD280为1.8-2.0,逆转录试剂盒(TaKaRa)转录合成cDNA。采用qRT-PCR试剂盒(德国Qiagen公司)配制25 μL反应体系:SYBR Green I qPCR Master Mix 12.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA模板2.5 μL,ddH2O 9 μL。混匀后在荧光定量PCR仪(美国ABI公司)中进行扩增,反应设置为95 ℃预变性2 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40个循环。以U6为内参基因。根据NCBI相应的序列设计引物,引物序列见表1。反应结束后采用2-ΔΔCt法计算miR-126、miR-325的相对表达量。使用特定的酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(Abcam,San Francisco,USA)检测血清、玻璃体中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平。使用酶标仪(EpochTMMicroplate Spectrophotometer,USA)测量450 nm处的吸光度。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1两组患者一般资料比较PVR组与对照组患者一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 两组患者一般资料比较

2.2两组患者血清和玻璃体中miR-126和miR-325水平比较PVR患者血清和玻璃体中miR-126水平较对照组降低,miR-325水平较对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.01),见表3。

表3 两组患者血清和玻璃体中miR-126和miR-325水平比较

2.3不同病变程度PVR患者血清和玻璃体中miR-126和miR-325水平比较重度组患者血清和玻璃体中miR-126水平较轻度组下降,miR-325水平较轻度组上升,差异均有统计学意义(P<0.01),见表4。

表4 不同病变程度PVR患者血清和玻璃体中miR-126和miR-325水平

2.4不同病变程度PVR患者血清和玻璃体中细胞因子水平比较重度组患者血清和玻璃体中TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平较轻度组上升,差异均有统计学意义(P<0.01),见表5。

表5 不同病变程度PVR患者血清和玻璃体中细胞因子水平比较

2.5PVR组患者血清miR-126和miR-325水平与细胞因子水平的相关性PVR组患者血清miR-126水平与miR-325、TGF-β、VEGF、TNF-α水平负相关(r=-0.677、-0.486、-0.498,-0.513,均P<0.05),与PDGF水平弱相关(r=-0.289,P<0.05)。miR-325与TGF-β、VEGF、TNF-α水平正相关(r=0.509、0.544、0.492,均P<0.05),与PDGF水平弱相关(r=0.253,P<0.05)。

2.6PVR组患者玻璃体中miR-126和miR-325水平与细胞因子水平的相关性PVR组患者玻璃体中miR-126水平与miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平负相关(r=-0.458、-0.375、-0.608、-0.478、-0.714,均P<0.05)。miR-325水平与PDGF、TNF-α水平正相关(r=0.527、0.562,均P<0.05),与TGF-β、VEGF水平弱相关(r=0.242、0.261,均P<0.05)。

2.7影响PVR病变严重程度的Logistic分析以是否发生重度PVR为变量(是=1,否=0)为因变量,以表4、5中有统计学差异性的miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平(均为实测值)为自变量,采用逐步回归法进行Logistic回归分析,提示血清和玻璃体中miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、TNF-α均是发生重度PVR的影响因素(均P<0.05),见表6。

表6 影响PVR病变严重程度的Logistic分析

3 讨论

PVR是一种致盲性疾病,与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的上皮细胞-间充质(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有关,病理发展过程为破坏血-视网膜屏障、使细胞增殖迁移、形成与收缩增殖膜、沉积细胞外基质(extracellular matrix,ECM)以及视网膜皱褶形成[11-12]。在因孔源性视网膜脱离而接受视网膜手术患者中,约5%-10%患者会发生PVR,占术后失败75%[11]。视网膜反复脱离和PVR的产生导致视网膜损伤,手术结果较差[13]。目前PVR发病机制尚不明确,但多项研究表明,miRNA与PVR发生、发展密切相关[14],因此分析血清和玻璃体中miRNA水平可能是识别疾病生物标志物一个有希望的热门领域。

研究发现,miR-126在视网膜病变中发挥作用,如miR-126-5p在糖尿病视网膜神经变性中表达下调,可作为评估视网膜神经变性的生物标志物[15]。Zheng等[16]发现与非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠血清和视网膜miR-126水平下调,向玻璃体内输送miR-126可缓解视网膜病变情况。然而miR-126、miR-325在PVR中的研究较少。本研究结果显示,在PVR患者血清和玻璃体中,miR-126表达量均下调,随着疾病加重进一步下调,且血清和玻璃体中高水平miR-126是发生重度PVR的影响因素,提示miR-126在PCR发生发展中发挥作用。PVR发生时,ECM和各种类型细胞会形成视网膜前膜(epiretinal membranes,ERM),导致视网膜皱褶的出现对视网膜进行牵拉最终导致视网膜脱离(retinal detachment,RD)[12]。有报道称miR-325-3p过表达可促进EMT进程[17]。本试验中PVR患者血清和玻璃体的miR-325表达量上调,且重度组高于轻度组,血清和玻璃体中高水平miR-325是发生重度PVR的影响因素,提示miR-325可能在PVR中发挥致病作用。本试验中还发现,PVR患者血清和玻璃体miR-126与miR-325水平呈负相关,提示miR-126、miR-325表达可能相互调节共同参与PVR的发生发展,并且与PVR的严重程度有关。

几乎PVR所有危险因素都与RPE在玻璃体中的扩散或血眼屏障的破坏有关[18]。在PVR患者的视网膜撕裂过程中,分离RPE细胞会接触到玻璃体,导致玻璃体刺激视网膜表面RPE细胞的迁移;同时,炎症介质等促进RPE细胞产生胶原蛋白,进一步导致ERM形成和收缩[19]。由此可见,RPE细胞是ERM形成的主要参与者,在PVR中起着至关重要作用。生长因子和炎症因子都是PVR中EMT过程的介质,主要包括TGF-β、TNF-α、PDGF以及黏附因子ICAM-1等[20]。研究发现,PVR中ERM发生与TGF-β和TNF-α信号通路激活有关,且TNF-α信号通路是该过程中的关键,这些因素协同激活成人RPE细胞中的EMT程序[21]。也有研究表明TGF-β、TNF-α和PDGF上调与PVR的严重程度密切相关[22]。Hsiao等[23]表明TGF-β2的释放可能促进人类RPE细胞中VEGF产生。本研究结果与Mudhar[22]研究类似,在PVR重度组患者的血清和玻璃体中,TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF水平均显著高于轻度组。进一步分析显示,上述指标与miR-126水平均呈负相关,而与miR-325水平均呈正相关。在增殖型糖尿病视网膜病变中,miR-126已被证实,可通过靶向VEGF调节血管发育,进而影响视网膜病变过程[24]。因此推测,miR-126在PVR进展中的作用可能与靶向调节TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF有关。另外,miR-325-3p的表达已被证实可被TGF-β诱导,并对EMT有积极影响[25]。本研究推测miR-325在PVR中可能通过调节TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF等炎症因子和血管生成因子表达,影响视网膜中的炎症反应和EMT过程,进而促进视网膜前膜的沉积和剥离,导致PVR发生或进展。

综上所述,随PVR疾病的加重,血清和玻璃体中miR-126表达降低,miR-325表达升高,且与TGF-β、TNF-α、VEGF、PDGF具有相关性。二者可能通过调节炎症反应和EMT过程参与PVR的发生和进展,然而具体的作用和机制需要设计进一步的试验来确定。