微小RNA在脉络膜新生血管相关信号通路中的研究进展

杨凌齐,吕 洋

0 引言

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)指脉络膜血管的增殖性改变,通常分三型:Ⅰ型,新生血管局限于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)下,最终导致RPE与视网膜脱离;Ⅱ型,新生血管突破RPE-Bruch膜复合体向视网膜神经上皮下、RPE上增殖;Ⅲ型,新生血管起源于视网膜内,随后向视网膜下间隙和脉络膜发展[1-2]。目前研究发现,CNV与40多种眼部疾病相关,是多种致盲性眼病的病理基础,其发生机制极其复杂,涉及多种细胞、细胞因子及信号通路,其中,在CNV微环境中,微小RNA(microRNA,miRNA/miR)参与调控眼内新生血管、氧化应激、免疫反应的研究不胜枚举[3-5],因此,深入探究miRNA介导的信号通路在CNV中的表达,有望为CNV治疗提供新的靶点。

1 miRNA生物学特性

miRNA是近年研究较多的一类非编码RNA分子,其长度为18-25 nt,存在于真核生物中。人体基因组中已检测到400多种miRNA,其调控约30%的蛋白编码基因[6]。每一个miRNA通常以碱基配对的方式结合信使RNA(message RNA,mRNA)序列的3’非编码序列(untranslated regions,UTR),在转录后调节基因表达,根据互补程度抑制靶基因mRNA的翻译;其次,当miRNA与靶点完全或相对完全互补时,也引发mRNA降解;此外,miRNA通过使CpG岛甲基化发生异常,可直接调控靶基因转录[6]。一种miRNA可以靶向超过200种mRNA,而一种mRNA又可受多种miRNA调控。研究已表明,miRNA在血管生成、免疫炎症反应及细胞增殖、分化、凋亡等生物过程中发挥重要作用[7-9]。同时,miRNA也被证明参与调控神经退行性疾病,如阿尔兹海默症、多发性硬化症及糖尿病视网膜病变(DR)等[10-11]。

2 miRNA在激光诱导小鼠CNV中的表达

激光诱导的CNV小鼠模型是近年来研究眼底血管疾病的重要途经,越来越多的研究表明,在小鼠CNV模型中,不同形式的miRNA在调控CNV形成过程中起到促进或抑制作用。在激光诱导的小鼠CNV模型中,miR-505高表达的同时病灶区血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白也显著增加;玻璃体内注射miR-505抑制剂后,CNV病灶面积明显降低[12]。研究表明,与对照组(无激光诱导的小鼠)相比,实验组(激光诱导后36 h)小鼠脉络膜组织中miR-155表达下调,随后行脉络膜铺片发现,玻璃体内注射miR-155模拟物(miR-155 mimic)后荧光素渗漏明显降低,且CNV病变大小也相应减小[13]。在嵌合体小鼠CNV模型中,玻璃体内注射miR-188-5p模拟物后,CNV病变组织中基质金属蛋白酶2/13(matrix metalloproteinase,MMP-2/MMP-13)水平明显降低且CNV病灶面积也随之减小[4]。为明确miR-126-3p和miR-126-5p过表达是否能促进CNV生成,在激光损伤视网膜后注射两者的模拟物,2 wk后检测显示miR-126-3p mimic导致CNV病灶面积减少约60%,而后者则轻度增加了CNV损伤面积[14]。研究发现,激光诱导的小鼠CNV模型中,RPE/脉络膜组织中既低表达miR-93,也高表达VEGF-A mRNA和蛋白,表明在小鼠CNV模型中,过表达miR-93后可下调VEGF-A mRNA和蛋白水平,从而抑制CNV形成[15]。既往研究表明CNV小鼠中过表达miR-126后VEGF-A、VEGFR-2和Sprouty相关EVH1域含蛋白1(SPRED-1) mRNA和蛋白表达均显著降低[16]。此外,在激光烧伤后的CNV模型中立即注射miR-195a-3p mimic,7 d后发现血管密度及CNV病变面积均明显降低[17]。另有研究发现,经过多次激光灼伤的小鼠CNV模型血浆中miR-96、miR-182和miR-183水平明显升高[18]。总之,在激光诱导的小鼠CNV模型中,miRNA作为特异性调控因子促进或抑制CNV生成的事实不断被揭示,但还需进一步研究miRNA通过何种信号通路参与调控CNV的发生发展。

3 miRNA调控CNV的相关信号通路

3.1PI3K/Akt信号通路磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一种存在于细胞内的信号蛋白,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,其由调节性亚基p85和催化亚基p110构成,可以促使其下游靶点丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)发生磷酸化,共同构成PI3K/Akt信号通路[19]。PI3K信号通路由各种生长因子如表皮生长因子、VEGF、成纤维细胞生长因子等激活,参与调控多种细胞活动、促进血管形成及基因表达等[20]。有研究使用慢病毒转染miR-155发现,无论是在体内还是体外,miR-155直接抑制含SH2结构域的肌醇5磷酸酶1(SHIP-1)的表达并降低PI3K/Akt信号通路中效应分子的磷酸化,从而抑制CNV的形成[21]。此外,在小鼠CNV模型和骨髓来源的原代巨噬细胞中,miR-155靶向炎症激活转录因子(C/EBPβ)抑制M2型巨噬细胞,进而抑制VEGF的表达和CNV形成[13]。研究证实,CNV形成涉及血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)向血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)迁移、增殖及分化,EPCs表面趋化因子受体4(CXC chemokine receptor,CXCR4)与基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)结合,活化PI3K/Akt信号后促进VEGF诱导的EPCs迁移,进而促进新生血管形成[22]。研究发现,过表达miR-200b后可抑制VEGF/PI3K/Akt信号通路从而抑制CNV的形成[23]。在人脐带间充质干细胞(hucMSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中发现,过表达miR-126-3p后可促进VEGF诱导的EPCs增殖、迁移,提高CNV形成的能力,而引起这一结果归因于miR-126-3p下调靶基因SPRED-1和磷脂酰肌醇3激酶受体2(PIK3R2),增强PI3K/Akt信号通路,达到促进血管新生的目的[24]。在激光诱导的小鼠CNV模型中,转染miR-342-5p后能抑制VEGFR2和VEGFR3的表达,且减弱了VEGF诱导的Akt磷酸化,从而降低CNV形成的能力[25]。另有研究发现,在大鼠角膜新生血管中,高表达miR-145-5p的同时VEGFR2/PI3K/Akt表达随之上调,因此miR-142-5p可能调控PI3K/Akt信号通路引起大鼠角膜CNV形成[26]。

3.2TGF-β信号通路转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在CNV形成过程中发挥重要作用。TGF-β超家族受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体,即TGF-βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)、TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)。TGF-β信号转导途径分为两种:(1)TGF-β激活Smad蛋白依赖性信号传导通路,如激活素/TGF-β特异性R-Smads和BMP特异性R-Smads;(2)TGF-β激活Smad蛋白非依赖性信号传导通路,如PI3K/Akt信号通路和MAPK通路等。研究表明,miRNA对TGF-β信号通路具有一定的调控作用,同时TGF-β也可影响miRNA的表达。在ECs中,通过激活素受体样激酶1(ALK1)/TGF-β信号途径诱导Smad1/Smad5刺激ECs迁移、增殖和管腔形成;通过ALK5/TGF-β信号途径诱导Smad2/Smad3抑制血管生成。miR-155可靶向结合Smad2的3’UTR,下调Smad2表达,抑制TGF-β/Smad2信号转导及VEGF-A分泌,从而抑制CNV形成[27]。在CNV模型中,通过调控ALK5/TGF-β/Smad2信号通路后可上调miR-34a-5p、miR-135a-5p及miR-10b-5p的表达,抑制VEGF分泌及CNV形成[28]。miR-342-5p靶向内皮糖蛋白(endoglin)并通过抑制ECs中的Smad1/5磷酸化干扰TGF-β信号,从而抑制ECs增殖和管腔形成,并减少体外和体内血管生成[25]。大鼠糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)实验中,miR-192通过靶向早期生长反应因子1(early growth response-1,Egr1)调控TGF-β信号在预防DN过程中发挥重要作用,然而miR-192调控TGF-β信号在CNV中的作用有待进一步研究[29]。

3.3NF-κB信号通路核因子-κB(NF-κB)是细胞内重要的核转录因子,参与机体免疫炎症、调节细胞增殖、凋亡及血管生成。NF-κB是一种异源二聚体蛋白,该家族有5个成员,即NF-κB1(p50)、NF-κB2 (p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel。通常所说的NF-κB蛋白是指p50/p65亚单位形成的NF-κB1二聚体蛋白。NF-κB信号转导包括经典途径、旁路途径和非经典途径。过表达miR-155可促使NF-κB核转位,因此下调miR-155表达可抑制Toll样受体4(TLR4)/NF-κB通路的激活,抑制内皮细胞炎症反应[30]。在用骨髓源性M1型巨噬细胞干预的ECs中,miR-155高表达且通过靶向细胞因子信号传导抑制因子6(SOCS6)抑制p65泛素化及降解,激活NF-κB信号通路,从而调控血管内皮细胞上皮间质转化[31]。OTUD7B是OTU家族泛素酶卵巢蛋白酶成员之一,OTUD7B去泛素化能抑制NF-κB核移位和转录活性。在HUVECs中发现miR-146a-5p与OTUD7B存在靶点关系,下调miR-146a-5p靶向OTUD7B使NF-κB信号通路失活从而抑制CNV形成[32]。在DR模型中,miR-874通过靶向p65降解调控NF-κB信号通路,进一步减弱DR中血管生成[33]。在肝癌细胞中,三氧化二砷(As2O3)作用于miR-491t调控的TGF-β/Smad3/NF-κB通路中,不仅能减弱血管且降低VEGF的分泌及血管生成能力[34]。

3.4Notch信号通路Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物中,在进化上高度保守,通过细胞间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1-4)和5种Notch配体(Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged-1和Jagged-2)。Notch信号通路活化有两条途径,即经典的Notch信号通路(又称CBF-1/RBP-Jk依赖途径)和CSL(DNA结合蛋白)非依赖途径。当Notch配体与靶细胞的Notch受体结合时,CSL与其受体胞内段(NICD)结合将启动Notch信号激活[35]。CNV形成主要受VEGF调控,而VEGF能够促进ECs中Delta-like-4(DLL4)的表达,从而使ECs在VEGF/Notch信号通路作用下发生增殖和迁移[36]。近年研究表明,miRNA中miR-150、miR-342-5p、miR-223-3p、miRNA-10等在调控Notch信号通路参与CNV的形成中发挥关键作用。在正常人视网膜血管中,miR-150表达丰富,其不仅通过抑制下游靶基因CXCR4、DLL4及FZD4抗原(重组蛋白)维持血管处于静止状态,且能抑制内皮细胞增殖、迁移和成管功能;然而,在CNV病变中,miR-150表达下调并靶向内皮细胞中血管生成调节因子CXCR4、DLL4和FZD4,进而促进CNV形成[37]。miR-324-5p作为一种多功能血管生成抑制因子,不仅是VEGFR和TGF-β信号传导的关键分子,也是Notch通路的下游分子,通过下调Notch信号中Jagged-1减弱ECs增殖、迁移的能力,抑制血管生成[25]。此外,miR-223-3p也作为Notch信号传导的下游分子之一,直接靶向F-box和WD-40结构域蛋白7(Fbxw7),调控ECs增殖和迁移功能;而过表达Fbxw7后可抑制由miR-223-3p引起的ECs增殖与迁移,提示Notch信号通路可通过激活miR-223-3p靶向Fbxw7抑制ECs迁移和“芽生”[38]。可溶性FMS样酪氨酸激酶1(sflt-1)是一种具有抗血管生成特性的酪氨酸蛋白激酶,与VEGF及胎盘生长因子(PlGF)结合可降低游离VEGF和PlGF的浓度并减少血管生长。最初在斑马鱼中证明miR-10转录后直接调控sflt-1,从而调节血管生成,后续研究发现sflt-1并不是miR-10的唯一靶点,miR-10可以靶向斑马鱼中的E3泛素蛋白链接酶1(Mib1),而Mib1通过泛素化Notch受体正调控Notch信号通路,表明miR-10a/10b以Notch依赖性方式直接靶向Mib1调节血管形成[39]。

3.5Wnt信号通路Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质调控网络,其参与血管新生是近年研究的热点,通过使ECs增殖、迁移、“芽生”等促进脉管系统成熟的多个阶段诱导血管发生[40]。Wnt信号通路包括经典途径和非经典途径。β-catenin是经典Wnt信号通路中的核心调控因子,其表达水平决定通路的开放与否。当Wnt/β-catenin信号通路激活后,Wnt分子与Frizzled受体(FZD)及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)相结合,激活胞内散乱蛋白(disheveled,Dvl),从而避免β-catenin被降解,使其聚集并转移至细胞核,启动下游靶基因的转录。在小鼠CNV模型中,过表达miR-150后下调FZD4可抑制Wnt/β-catenin信号通路,减弱CNV的形成[37]。Jiang等[41]在前列腺癌(PCa)组织中检测PCa相关基因,发现小脑锌指蛋白2(zinc finger protein-2,ZIC2)是miR-129-5p的靶基因,其可通过Wnt/β-catenin途径下调ZIC2,抑制上皮间充质转化及血管生成,达到减缓PCa进展的目的。此外,有学者发现ZIC2是病理性近视的易感基因[42],因此,miR-129-5p是否通过ZIC2/Wnt/β-catenin信号通路调节CNV的发生发展,还有待进一步研究。研究发现,VEGF通过崩解素-金属蛋白酶10(ADAM10)诱导神经蛋白-1(NRP1)裂解从而调控血管生成,而miR-655-3p通过介导ADAM10抑制Wnt/β-catenin信号通路进而降低肝细胞癌的发生,且miR-655-3p可直接靶向VEGF抑制上皮性卵巢癌的增殖和侵袭[43-45]。因此,miR-655-3p是否可以通过VEGF/ADAM10/Wnt/β-catenin信号通路参与CNV的形成,仍有待进一步研究。有研究在探讨牵张成骨血管发生机制中分别预测了miR-486、miR-21、miR-27b、miR-205的靶基因,发现这些miRNA不仅通过调控靶基因参与EPCs血管发生,而且与Wnt信号通路和FoxO信号通路有交集,从而证实上述4种miRNA通过调控Wnt信号通路参与EPCs血管发生[46],但该研究就miRNA如何介导Wnt信号通路调控靶基因参与EPCs血管形成尚未讨论。

4 小结与展望

脉络膜新生血管是多种致盲性眼病的病理基础,导致中心视力丧失,严重威胁着人类的健康和生活质量。然而,CNV的发病机制仍未完全阐明。随着学者对miRNA的深入研究,越来越多的miRNA介导信号通路参与CNV的研究被揭示,汇总近年关于miRNA调控各种信号通路参与CNV发生发展的相关研究[4,13,23-25,27-30,32-34,37-39,42-53]见表1。在CNV进展中,这些miRNA不仅参与一种信号通路,而是涉及多个信号通路共同激活相互作用。然而,又有新问题有待发现及解决,如miRNA靶向特定基因介导肿瘤性疾病的信号通路是否也参与CNV的发生发展,此外,又有许多表达于CNV中的miRNA基于何种蛋白基因作用于信号通路从而影响CNV发展,这些问题都是未来研究的方向,为进一步阐明CNV发病机制及CNV的靶向治疗提供新思路。

表1 miRNA调控相关信号通路参与CNV形成的研究汇总