采用自适应光学扫描激光检眼镜系统观察健康成年人黄斑区视锥细胞的分布

赵 玥,杨婷婷,姚 进

0 引言

自适应光学扫描激光检眼镜(adaptive optics scanning laser ophthalmoscope,AO-SLO)系统[1-4]作为一种新型的眼科影像检查设备,是一种利用自适应光学(adaptive optics,AO)技术充分校正人眼像差,结合扫描激光检眼镜(scanning laser ophthalmoscope,SLO)获得视网膜高分辨率视细胞图像的自动控制系统。目前主要用于对眼底结构的活体显微成像,提供视网膜细胞及血管的图像,通过对视网膜图像进行后处理,获取如感光细胞密度、血管管径、血流速度等参数[5-7]。该系统通过校正像差将横向分辨率提高到细胞级别,光学分辨率可达2 μm[8],不仅在形态上能够在细胞水平对视网膜进行可视化,而且可以动态观察细胞及血管的变化,将一些视网膜疾病的发病机制及病理研究提前到细胞未死亡、仅有形态变化的阶段,提高了疾病的超早期诊断率,为临床进一步了解视细胞和视网膜血流的变化提供了无创快捷的影像学资料,为深入了解视网膜和脉络膜疾病的发病机制开辟了新的途径。本研究通过AO-SLO系统观察不同年龄健康人黄斑区视锥细胞,了解其分布特点及其与年龄的相关性,现报告如下。

1 对象和方法

1.1对象选取2023-06/07于我院进行健康体检者100例200眼,年龄18-65(平均31.73±11.98)岁,其中男45例,女55例。纳入标准:(1)行裂隙灯及眼底镜检查均未发现明显器质性病变;(2)医学验光矫正视力均≥0.8(小数视力);(3)年龄18-75岁。排除标准:(1)眼压(intraocular pressure,IOP)>21 mmHg或其他原因不能进行散瞳者;(2)球镜度超过±2 D或柱镜度超过±1 D,等效球镜度超过±2.50 D;(3)眼轴长度≥26 mm或≤23 mm;(4)上睑下垂等无法充分暴露瞳孔区者;(5)无晶状体眼或人工晶状体眼;(6)患有流行性角结膜炎或处于其他传染性疾病活动期,屈光介质混浊而无法获得满意图像者;(7)固视不良,或其他原因无法配合检查者;(8)患有高血压、糖尿病、心脏病等全身疾病或既往有眼部疾病史者;(9)色觉检查异常者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》,已通过南京医科大学眼科医院伦理委员会审批[No.伦理新技术字第(2023001)号],所有研究对象均了解本研究相关内容并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1一般检查纳入研究对象均行最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、IOP、色觉、眼轴、医学验光等检查,并采用共焦激光同步血管造影系统(Heidelberg Spectralis,HRA+OCT)进行光学相干断层扫描成像(optical coherence tomography,OCT)检查,对黄斑区视网膜进行区域多线扫描,测量中心凹下视网膜厚度(central macular thickness,CMT)。所有检查均由同一名医师完成。

1.2.2AO-SLO检查采用Mona Ⅱa自适应光学扫描激光检眼镜系统(南京博视医疗科技有限公司,设备软件版本号V1.00.00.221115)进行检查。检查前使用5%复方托吡卡胺散瞳,瞳孔直径大于6 mm且直接、间接对光反射消失后进行检查,分别采集双眼中心凹上方(superior)、下方(inferior)、鼻侧(nasal)及颞侧(tempo)偏心率3°处的2.4°×2.4°视锥细胞层图像,同一位置重复采集2次并记录测量结果,取平均值。操作方法:在信息管理界面输入受检者基本信息,输入屈光度及眼轴数据以在扫描中自动校正眼底放大倍率。扫描过程中调整瞳孔相机的位置及景深,确保瞳孔居于中央且虹膜影像清晰后点击“AO”键启动自适应矫正,通过左右轻微拖动深度调节键,确定采集深度,采集图像前嘱受检者瞬目或多次瞬目后保持睁眼并注视绿色固视灯,确认波前点阵图清晰规则接近类圆,此时细胞结构镶嵌最为清晰,然后迅速点击采集按钮,等待3 s采集结束即可查看采集图像的清晰度。在扫描成像过程中,根据机器对焦时调节深度显示在原位0 μm可知获得的图像为椭圆体带层面,结合已有文献[9]中电镜下视锥细胞切片图及其他自适应光学相关研究,可以判断扫描的图像为视锥细胞形态。视锥细胞密度指区域内的视锥细胞数量除以面积的值;细胞间距指每个视锥细胞与其相邻视锥细胞之间的平均距离。采集时所有图像的收敛实时信号强度均为90%以上,以保证最终图像的质量及可信度。所有检查均由同一名医师完成。

2 结果

2.1纳入研究对象临床基本资料比较根据年龄将纳入研究对象分为4组,其中A组年龄18-30岁,B组年龄31-40岁,C组年龄41-50岁,D组年龄51-65岁,每组各25例50眼。纳入研究对象色觉检查均正常。各组研究对象年龄、BCVA、等效球镜度差异均有统计学意义(P<0.001),性别构成、IOP、眼轴及CMT差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组研究对象临床基本资料比较

2.2纳入研究对象视锥细胞间距比较各组研究对象双眼中心凹偏心率3°处2.4°×2.4°范围平均视锥细胞间距差异均有统计学意义(P<0.001),见表2。

表2 各组研究对象中心凹偏心率3°处2.4°×2.4°范围平均视锥细胞间距比较

2.3纳入研究对象视锥细胞密度比较各组研究对象双眼中心凹偏心率3°处2.4°×2.4°范围视锥细胞密度差异均有统计学意义(P<0.001),且各组研究对象各区域视锥细胞密度均呈现较为规律的分布特点,均以颞侧视锥细胞密度最高,由高至低依次为颞侧>鼻侧>下方>上方,见图1、2,表3。各组研究对象双眼黄斑区平均视锥细胞密度分别为14144.38±1082.40、13241.24±535.32、12930.29±727.73、10907.50±490.86 cell/mm2,差异有统计学意义(F=83.76,P<0.001),提示随着年龄的增长,视锥细胞密度呈下降趋势。

图1 各组研究对象中心凹偏心率3°处的视锥细胞示意图(图像大小100 μm×100 μm)。

图2 各组研究对象双眼中心凹偏心率3°处2.4°×2.4°范围各区域平均视锥细胞密度比较。

表3 各组研究对象中心凹偏心率3°处2.4°×2.4°范围视锥细胞密度比较

2.4视锥细胞密度与年龄的相关性Pearson相关性分析显示,纳入研究对象100例200眼黄斑区平均视锥细胞密度与年龄呈负相关(r=-0.578,P<0.001),见图3。

图3 纳入研究对象视锥细胞密度与年龄的相关性。

3 讨论

自2000年AO技术首次应用于临床[2,10-16],即突破了单个细胞的可视化只能使用组织学技术来实现的不足,逐步开展了在视锥细胞、视网膜血管和其他视网膜结构(如玻璃膜疣、微动脉瘤、出血等)方面的多项研究[9,17-19]。由于AO-SLO可以对活体视网膜中单个细胞直接成像,作为更细微的影像形式对其他眼底成像如OCT、光学相干断层扫描血管成像(optical coherence tomography angiography,OCTA)、眼底自发荧光(fundus autofluoresceine,FAF)、眼底荧光血管造影(fundus fluoresceine angiography,FFA)、吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)等进行补充,从微观角度观察视锥细胞改变及丢失的区域和范围[20],量化测量研究可以帮助临床得以在区域内进行细胞密度等定量测定,使对细胞的定量观察成为可能。

视锥细胞通常以六边形点阵排列[11,21],既往其识别是通过半自动方法,先自动检测视锥细胞的中心,再由有经验的人员进行手动校正,较为费力和耗时。目前研发应用于临床的AO-SLO系统有效提高了视锥细胞的自动检测分析能力。在对细胞进行识别后,系统自动测量获得的指标如视锥细胞密度和细胞间距均是有临床意义的生物标志物。在最初使用时,认为首先进行对于健康眼的检测分析是非常重要的,因为其结果有助于建立基础数据库,获得健康人生理改变的基础信息,在临床中用于评估患眼的异常变化,分析其与健康眼的偏差,对于眼底疾病的早期诊断和监测具有重要的参考价值。

目前已有多项研究发现,视皮质神经细胞、双极细胞、神经节细胞、色素上皮层细胞及细胞内的黑色素均会随年龄增长而逐渐减少,视神经纤维束间结缔组织常随年龄增长而逐渐增生,视神经传导功能减弱[22-25]。本研究发现,中心凹周围视锥细胞密度同样会随着年龄递增而降低,这与既往研究[26-27]测量的不同年龄健康受试者在不同偏心率上视锥细胞密度的变化结果一致。本研究还发现,尽管不同年龄人群中心凹旁视锥细胞密度会存在一定的波动与偏差,但整体分布仍较为规律,均以颞侧密度最高,由高到低依次为颞侧>鼻侧>下方>上方,分析认为这样的规律可能与中心凹颞侧视网膜血管分布较少有关。此外,本研究发现,50岁以上健康人群中心凹旁各方位视锥细胞密度均下降明显,在同一放大倍率下观察不同年龄研究对象的视锥细胞形态,发现功能正常的视锥细胞呈蜂窝状均匀分布,境界清晰,随着年龄递增,尤其是进入50岁以后,区域内的高反射细胞增多,视锥细胞密度减少,细胞胞体及间距增大,但形态仍然规则,推测这可能进一步提示了以上均是与年龄相关的视锥细胞功能下降的特征。

清晰的细胞成像主要取决于受检者的屈光状态与屈光介质的清晰程度,因此本研究纳入的研究对象等效球镜度均不超过±2.50 D以保证检测结果的可靠性。通常球镜±5.00 D以内,柱镜±1.5 D以内,眼轴<26 mm的眼成像质量较好。虽然从原理上讲眼轴对于成像质量无影响,但实际操作来看,长眼轴(>26 mm)确实会导致细胞成像不理想,主要表现为细胞变小导致成像不清晰,此时可尝试戴镜测量,但需受检者手扶镜框,保证光学中心与瞳孔对齐。如果成像质量还不理想,则放弃。柱镜补偿理论上可达到±2.00 D,但实际操作中发现>±1.5 D时会出现图像中央清晰,周边不清晰的现象,推测可能是由于柱镜轴向的原因导致清晰位置不同。

由于目前光学成像技术限制,中心凹处的视锥细胞尚无法成像,因此本研究选取中心凹偏心率3°处的位置,考虑到人眼视网膜结构的特点,距离中心凹越远的位置,视锥细胞密度越小、面积越大,而中心凹偏心率3°处的视锥细胞密度高、体积小,同时可以避开中心凹凹陷结构造成的反射不均匀情况,又最为贴近中心凹,因此对此处最具有代表性的位置进行图像采集和评估。选取2.4°范围的视锥细胞主要是考虑到希望有足够的图像清晰度和精准度以保证研究结果的准确性,同时一些可能会影响测量结果的因素如屈光介质混浊、泪膜不稳定等,在本研究过程中也均进行了严格筛选,基本摒弃了可能存在影响结果的因素。然而,本研究也存在一些不足,如欠缺对于可能与视锥细胞相关的影响因素更为细致的研究,如眼轴、屈光度、中心视力、色觉、眼压实际值等;未对中心凹偏心率3°以外更大范围的视锥细胞密度是否会随着年龄增加而递减、不同范围内的差异性以及与其他细胞相关检测项目进行对照研究等进行探讨,这些均有待于临床进一步观察。