驴脂肪酸去饱和酶2基因克隆及组织表达规律的研究

黄 飞 杜心怡 刘桂芹 王长法 周苗苗

(聊城大学农学与农业工程学院,毛驴高效繁育与生态饲养研究院,聊城 252000)

脂肪酸去饱和酶2(fatty acid desaturase 2,FADS2)是脂肪酸去饱和酶家族成员之一,是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)合成代谢途径中关键的限速酶[1]。众多研究表明,FADS2在脂肪酸代谢过程中发挥重要作用。欧小倩等[2]研究发现,FADS2能调节鸡肉中不饱和脂肪酸含量,进而影响鸡肉的品质和风味。陈兴勇等[3]研究发现,育肥期皖西白鹅肝脏中FADS2基因相对表达量上升伴随着肌肉中单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)含量的增加和不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)/饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)比值的上升。马小娅等[4]研究发现,FADS2可以调控奶牛乳腺上皮细胞中脂质的合成,干扰或过表达FADS2基因均可降低奶牛乳腺细胞中甘油三酯的含量。王梦琦等[5]研究了中国荷斯坦牛FADS2基因c.908 C>T突变对泌乳性能和乳中脂肪酸组成的影响,结果发现FADS2基因编码区c.908 C>T有CC、CT和TT 3种基因型,其中TT基因型具有较高的日产奶量、总固体和C16∶1含量及C16和C18不饱和指数。邬娇等[6]研究了原代奶山羊乳腺上皮细胞中PUFAs及其衍生物合成的代谢调控,结果发现FADS2能够调控奶山羊乳腺中PUFAs合成及甘油三酯代谢。此外,很多研究证实FADS2参与了鱼[7-10]、猪[11-13]、豚鼠[14]等动物体内的脂肪酸代谢调控。亦有研究表明,FADS2与人肥胖、胰岛素抵抗和皮肤病等疾病有关[1]。

驴肉中的SFAs含量较低,PUFAs含量较高,营养指标优于传统的牛肉和猪肉[15]。驴乳脂肪酸组成也主要以UFAs为主,含量高达62.9%,其中C18∶2与C18∶3的含量约占24%,与人乳和牛乳分别占8%和4%相比,驴乳的脂肪酸组成是比较理想的[16];此外,驴乳中乳脂共轭亚油酸含量高,具有抗肿瘤、抗氧化等功效[17]。目前关于驴UFAs合成调控方面的研究较少,鉴于此,本研究拟通过设计驴FADS2基因引物,PCR克隆得到其CDS序列,进行生物信息学分析并检测其在驴不同组织中的相对表达量,初步探讨FADS2在驴UFAs合成中的作用,旨在为进一步研究驴UFAs的合成调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本采集

选取4头健康的德州驴母驴,屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、乳腺和皮下脂肪,液氮速冻,-80 ℃冷冻保存。

1.1.2 主要试剂

Trizol试剂、Lipofectamine 3000、pcDNA3.1/Myc-His 载体,购自美国 Invitrogen公司;PrimeScript®RT反转录试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞,购自TaKaRa公司;Pfu高保真聚合酶,购自北京Transgen Biotech公司;胶回收试剂盒,购自广州Magen公司;EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶,购自Bio-Lab公司;胎牛血清,购自杭州四季青生物工程材料有限公司;Ham’s F12培养液,购自美国Gibco公司;细胞裂解液,购自瑞士Roche公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和全长cDNA克隆

Trizol法提取驴肝脏总RNA。PrimeScript®RT反转录试剂盒合成cDNA。使用高保真酶以FADS2基因的cDNA为模板扩增;PCR引物见表1,本试验所用PCR反应体系总体积为50 μL:5×Buffer 10 μL、脱氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)4 μL、上游引物(10 μmol/L)1.5 μL、下游引物(10 μmol/L)1.5 μL、酶(2.5 U/μL)0.5 μL、模板2.0 μL、双蒸水30.5 μL。PCR反应条件为:98 ℃ 10 s→55 ℃ 5 s→72 ℃ 1.75 min(扩增35个循环)→72 ℃ 5 min。PCR产物在电泳检测后,用胶回收试剂盒(Magen)回收并纯化目的产物。胶回收产物连接克隆载体pTOPO-Blunt cloning kit(CV16)转化DH5α感受态细胞,涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素LB平板于37 ℃培养过夜后,挑取阳性菌落PCR鉴定,并交由公司测序。

1.2.2 FADS2生物信息学分析

通过ORF Finder推导氨基酸序列;利用计算机pI/Mw工具(ExPASy Proteomics Server)、NetNglyc、NetPhos等在线预测工具,预测FADS2蛋白的分子质量、理论等电点、二级结构、跨膜区等,生物信息学分析见表2;通过Clustalx、DNAstar等工具对FADS2基因编码区进行多重比对和同源性分析,再利用MEGA11构建系统进化树[18]。

表2 生物信息学分析

1.2.3FADS2基因组织表达分析

Trizol法分别提取各组织的总RNA,参考文献[19]中操作流程,取1 mg RNA,用Prime Script®RT试剂盒合成cDNA。然后用SYBR®TrimeScriptTM试剂盒在ABI 7500上测定FADS2基因相对表达量。RT-qPCR反应体系为20 μL。PCR引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,采用2-△△Ct的方法计算FADS2基因相对表达量[20-21]。每个样品重复3次,超纯水替代样品做阴性对照。

1.3 统计与分析

本研究所有数据用SAS 9.2进行分析,2组数据间比较采用t检验,多组数据间采用单因素方差分析,数据用柱状图表示,误差线为标准差。当P<0.05时认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 FADS2基因的提取及克隆

Trizol法提取驴肝脏组织总RNA,RNA电泳图见图1-a。PCR特异性扩增FADS2基因,然后将PCR扩增产物进行电泳检测并回收。目的基因进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,可见1条约1 500 bp大小的条带(图1-b)。重组后菌液PCR产物电泳结果如图1-c。

a:1为Marker DL2000,2为FADS2 RNA;b:1为Marker DL2000,2～4为FADS2扩增产物;c:1为Marker DL2000,2～4为FADS2菌液PCR结果。

2.2 生物信息学分析

2.2.1FADS2基因序列同源性比对及系统进化树分析

经测序验证成功扩增FADS2基因。序列比对分析表明FADS2的开放阅读框为1 335 bp,可编码444个氨基酸残基组成的多肽链(图2)。首先,运用DNASTAR中的MegAlign软件将驴FADS2基因与GenBank中猪(Susscrofa,登录号:NM_001171750.1)、大鼠(Rattusnorvegicus,登录号:NM_031344.2)、狗(Canislupusfamiliaris,登录号:XM_014120904.3)、马(Equuscaballus,登录号:XM_023654186.1)、绵羊(Ovisaries,登录号:XM_015103138.3)、牛(Bostaurus,登录号:XM_015461240.2)、人(Homosapiens,登录号:NM_004265.4)、小鼠(Musmusculus,登录号:NM_019699.2)序列进行同源比对,结果如图3所示。运用MEGA11生成的驴FADS2基因编码序列与不同动物FADS2基因序列构建的系统进化树如图4所示。

图2 驴FADS2基因CDS及对应氨基酸序列

图3 驴与8个物种FADS2基因编码序列同源性比对

图4 基于不同动物FADS2的氨基酸序列的系统进化树

2.2.2 FADS2蛋白理化性质及亲/疏水性表达分析

利用ProtParam软件对FADS2蛋白进行预测,得出其分子式为C2451H3614N638O625S13;分子质量为52.43 ku;脂肪族指数为85;带负电荷残基总数(色氨酸、谷氨酸)为43个;带正电荷残基(精氨酸、赖氨酸)总数为45个;等电点为8.29,属于碱性蛋白;不稳定指数37.22,基因编码产物不稳定指数小于40,表明该基因编码产物稳定[22],属于稳定蛋白。氨基酸组成分析结果显示,FADS2蛋白含有20种氨基酸,其中占比最高的是亮氨酸(Leu),占9.0%;其次是苯丙氨酸(Phe),占7.9%;最低的是半胱氨酸(Cys),仅占0.5%。

利用ProScale分析驴FADS2蛋白亲/疏水性,发现在该蛋白质138位点上存在最大疏水值3.1;在102位点上存在最小疏水值-2.7(亲水);疏水性平均值为-0.231,属于亲水蛋白质(图5)。

图5 FADS2蛋白疏水性分析

2.2.3 FADS2蛋白二级结构及二硫键预测

通过NovoPro在线工具预测FADS2蛋白二级结构,发现FADS2蛋白二级结构中有230个α-螺旋(Hh)、47个β-折叠(Ee)和167个无规则卷曲(Cc),占比分别为51.80%、10.59%和37.61%(图6)。利用SCRATCH Protein Predictor在线工具预测,FADS2蛋白存在2个Cys和1个二硫键。二硫键的位置可能在蛋白质的364和407个氨基酸残基之间,可知2个Cys也分别位于肽链的364和407位置。

图6 FADS2蛋白二级结构预测

2.2.4 FADS2蛋白修饰位点预测

通过NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1预测驴FADS2蛋白糖基化修饰位点和磷酸化位点。发现在第45位氨基酸处存在N-糖基化位点,存在的可能性高达0.798 8;预测FADS2蛋白磷酸化位点结果显示FADS2蛋白有14个丝氨酸(Ser)、10个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,共26个。

2.3 FADS2基因组织表达分析

通过实时荧光定量PCR技术检测驴8个组织中FADS2基因相对表达量,发现在所有被检测组织中均检测到了FADS2基因。其中脂肪和乳腺组织中相对表达量最高,显著高于肺脏、肾脏、心脏、肝脏和肌肉组织(P<0.05);肝脏中FADS2基因相对表达量较低,仅显著高于肌肉组织(P<0.05)(图7)。

数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

FADS2是合成PUFAs过程中的第1个限速酶,在PUFAs的合成调控中起关键作用[23]。有研究表明,在高能量饲粮中添加藻类,可以通过上调FADS2等脂质代谢相关基因表达增加绵羊肝脏和肌肉中PUFA的含量[24]。给奶牛饲喂含有鱼油或微藻类饲粮,则下调了FADS2基因表达,降低了脂肪酸去饱和酶活性,最终降低了乳中UFAs的含量[25]。Huang等[26]研究表明,在山羊乳腺上皮细胞中miR-145通过调节FADS2等基因表达量来降低或升高UFAs比例,从而改善羊奶品质。Shi等[27]在山羊乳腺上皮细胞中的研究表明,抑制FADS2基因的表达,可以降低16碳UFAs的含量。另有研究表明,FADS2缺失会显著降低斑马鱼脂肪酸的去饱和作用,FADS2是高UFA合成过程中的必需酶[28]。

驴脂肪具有UFAs含量高的特点[15,29],但目前关于其形成机理研究较少。鉴于此,本试验进行了驴FADS2基因克隆及组织表达规律研究,结果发现,驴FADS2基因CDS长1 335 bp,可编码444个氨基酸,蛋白质分子质量为52.43 ku,等电点为8.29,不稳定指数为37.22,疏水性总平均值为-0.231,属于稳定碱性亲水蛋白。现有研究表明,FADS2基因在人、牛、水牛、小鼠、火鸡、鸡、瓦氏黄颡鱼、鲈鱼和山羊中普遍存在,在蜥蜴和腔棘鱼中不存在或尚未被注释[6,11,24-25,30-32]。覃川杰等[30]研究表明,瓦氏黄颡鱼FADS2 cDNA片段长2 041 bp,编码447个氨基酸。邬娇等[6]研究发现,在奶山羊中FADS2基因可编码443个氨基酸,比驴中少编码1个氨基酸;Geay等[9]研究发现,在欧亚鲈鱼中FADS2基因则可编码445个氨基酸;Li等[33]研究发现,人FADS2蛋白分子质量52.2 ku,比驴少230 u;在水牛中,马小娅等[34]研究发现,FADS2蛋白的分子质量比驴多80 u。

组织表达研究结果发现,在所有检测驴组织中均有FADS2基因表达,其相对表达量从高到低依次为脂肪、乳腺、脾脏、肺脏、肾脏、心脏、肝脏和肌肉。已有研究表明,FADS2表达受组织类型、生长周期、饲粮和激素等众多因素的影响。在奶牛中,泌乳期不同,FADS2表达量不同[35]。覃川杰等[30]研究发现,FADS2在瓦氏黄颡鱼脑和肝脏的表达量最高,显著高于肠道、脾脏、肾脏和鳃等组织。张丁丁等[31]研究亦发现,FADS2在鸡肝脏中的表达水平最高,在肾脏中的表达水平相对较高。Geay等[9]研究表明,在欧亚鲈鱼中FADS2主要在肝脏中表达。上述研究认为具有合成高UFAs的关键酶FADS2在肝脏中表达较高,这与肝脏为合成高UFAs的主要场所相符[30]。但是与上述研究结果不同,驴肝脏中FADS2相对表达量较低。推测其原因可能是受饲粮等其他因素的影响,具体分子机制有待进一步研究。本研究中,FADS2在驴脂肪和乳腺组织中相对表达量最高,提示驴脂肪和乳腺是合成高UFAs的主要场所。众多研究表明,驴脂肪和乳脂中UFAs含量较高,本研究结果表明,FADS2在驴脂肪和乳腺等组织脂肪酸代谢过程中可能发挥重要作用。

4 结 论

① 本试验成功扩增出驴FADS2基因,序列分析表明FADS2基因的开放阅读框为1 335 bp,可编码444个氨基酸残基组成的多肽链。

② 研究证实,FADS2基因在驴组织中普遍表达,其相对表达量从高到低依次为脂肪、乳腺、脾脏、肺脏、肾脏、心脏、肝脏和肌肉。