低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对哺乳犊牛直肠微生物的影响

■ 卢俊言 邹松岩 徐宏建 王明亚 吴春会 李秋凤* 李树静 张秀江

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2.河北天和肉牛养殖有限公司，河北石家庄 050200；3.保定农业农村局，河北保定 071051）

犊牛阶段是肠道菌群发育迅速的时期。犊牛出生时，肠道内环境由于吞咽和肠黏膜毛细血管的弥散处于有氧状态，此时有利于需氧菌和兼性需氧菌的繁殖，随着犊牛的生长发育，厌氧菌不断增多，肠道微生物菌群逐渐相对稳定[1]。此时，犊牛肠道微生物菌群组成除了受初乳、年龄、环境及基因型等相关因素影响之外，饲料也是影响肠道菌群的主要因素之一。因此，在此阶段摄入一定的开食料，才可满足犊牛生长发育需要[2]。低蛋白日粮不仅可避免蛋白质的浪费，还可以节能减排，但较低蛋白水平的日粮对动物的生长会产生负效应，因此在饲喂低蛋白日粮时需补充适当的氨基酸。研究表明，亮氨酸（Leu）作为一种必需氨基酸和支链氨基酸（BCAA），在骨骼肌中，大约80%被作为底物用于蛋白质合成[3]，促进蛋白质合成，而其余的则转化为α-酮异己酸酯（α-KIC）和β-羟基-β-甲基丁酸酯（HMB）[4]，其还可以作为信号分子参与多种生理功能的维持与调控[5]。胡军等[6]研究表明，日粮添加亮氨酸可以降低早期断奶仔猪肠道的活性氧水平。此外，亮氨酸对早期断奶湖羊羔羊瘤胃细菌菌群组成产生影响，从而影响瘤胃发酵[7]。Chen 等[8]研究表明，在哺乳期山羊日粮中添加亮氨酸可以提高粪便纤维降解菌的丰度等。色氨酸（Trp）及其代谢产物在抗应激、动物采食、免疫反应和抗氧化等方面均发挥着重要调节作用，肠道内的微生物也能够有效地利用色氨酸进行代谢，因此会出现色氨酸影响肠道微生物某些细菌丰度的情况。在实际应用中，日粮缺乏色氨酸会引发肠道炎症并改变肠道微生物生态系统[9]。在断奶仔猪饲粮中添加色氨酸可显著提高肠道微生物的α多样性和β多样性，并且能降低肠道病原菌梭状芽孢杆菌数量[10]。此外，色氨酸缺乏会降低SD 大鼠盲肠微生物多样性，主要影响拟杆菌门物种（普雷沃氏菌等）的多样性[11]。目前关于亮氨酸与色氨酸对犊牛直肠微生物影响的研究相对较少，因此本试验拟研究在低蛋白质日粮中补充Leu 和Trp 对断奶期犊牛直肠微生物的影响。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2022 年6—8 月，在河北省邢台市威县君凯牧业有限公司开展。

1.2 开食料及氨基酸

试验动物开食料原料由亿如科技（北京）有限公司加工制作；Leu 和Trp（纯度均为99%），购自北京亚禾营养高新技术有限公司。

1.3 试验设计及饲养管理

动物饲养试验在君凯牧业有限公司进行。选择初生体重[（40±2） kg]相近、健康状况良好的荷斯坦奶牛犊牛共75 头，采用完全随机试验设计，将犊牛按照初生体重随机分为5个组，分别为HK组（饲喂22% CP水平开食料）、LK组（饲喂19% CP水平开食料）、L组（饲喂19% CP水平开食料+1.15% Leu）、T组（饲喂19% CP水平开食料+0.26% Trp）、LT组（饲喂19% CP水平开食料+1.15% Leu+0.26% Trp）。试验期共49 d，饲养全期犊牛在犊牛岛饲喂，新生犊牛2 h内饲喂4 L初乳，12 h内额外再饲喂2 L。犊牛10日龄开始自由采食不同成分的开食料，自由采食燕麦干草，自由饮水。犊牛开食料组成及营养水平见表1。牛乳及干草营养水平见表2。

表1 犊牛开食料组成及营养水平（干物质基础，%）

表2 牛奶及干草营养成分（干物质基础，%）

1.4 样品采集

于犊牛59 日龄采集直肠粪便微生物样本，各组分别随机选择8 头犊牛，在犊牛排便15 min 内，用一次性无菌手套采集2～3 g 粪便于冻存管（灭菌）中，即刻放入液氮罐里，随后转移至-80 ℃冰箱中保存，待测。

1.5 指标测定

粪便微生物由南京派森诺基因科技有限公司检测，测定步骤及具体流程见表3。

表3 粪便微生物测定方法

1.6 数据整理与分析

试验数据使用Excel 2017 软件进行整理与计算，采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s 法进行多重比较。试验结果用“平均值”和“标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 低蛋白日粮补充Leu和Trp对哺乳犊牛直肠细菌丰富度和多样性的影响

如图1 所示，犊牛59 日龄时，所有粪便样品测序条趋近于40 000条时，Shannon指数趋近于饱和，且测序数量大于10 000条时稀释曲线趋于平缓，说明测序数量和测序深度合理，可以反映各个粪便样品中的微生物群落，能够满足后续试验要求。

图1 犊牛粪便微生物稀释曲线

如图2所示，犊牛59日龄，不同组犊牛共有分类操作单元（OTU）数量为641个。其中，HK组特有OTU数量为3 549 个，LK 组特有OTU 数量为2 514 个，L 组特有OTU数量为2 598个，T组特有OTU数量为2 572个，LT组的特有OTU数量为2 673个。

图2 犊牛粪便微生物Venn图

如图3 所示，犊牛59 日龄时，犊牛粪便微生物经主坐标分析（PCoA），第一主坐标贡献率为14.5%，第二主坐标贡献率为8.4%，各组之间至少有三个样品比较集中。说明群落组成相似，不同组间的距离也较近，不同组间的粪便微生物群落组成也较为相似。

图3 犊牛基于Weighted Unifrac距离PCoA分析

低蛋白日粮补充Leu 和Trp 对断奶期犊牛的粪便微生物Alpha多样性的影响见表4，犊牛59日龄时，各组 间Shannon、Simpson、Observed species、Chao1、Goods coverage和Pielou-e指数差异不显著（P>0.05）。

表4 低蛋白日粮中补充Leu和Trp对犊牛粪便微生物Alpha多样性影响

2.2 低蛋白日粮补充Leu和Trp对哺乳犊牛直肠微生物菌群相对丰度的影响

低蛋白日粮补充Leu 和Trp 对犊牛粪便微生物门水平上的影响见表5。犊牛59 日龄时，低蛋白日粮补充Leu和Trp对犊牛粪便微生物对门水平上前10个物种相对丰度无显著影响（P>0.05）。

表5 低蛋白日粮中补充Leu和Trp对犊牛粪便微生物门水平的影响

低蛋白日粮补充Leu和Trp对犊牛粪便微生物属水平上的影响见表6。犊牛59 日龄时，LK 组与HK 组相比，粪杆菌属（Faecalibacterium）相对丰度显著降低（P<0.05）；与LK组相比，L、T、LT组粪杆菌属（Faecalibacterium）相对丰度提高，且L组显著提高（P<0.05）。其他菌属各组间相对丰度差异不显著（P>0.05）。

表6 属水平上TOP 10的物种相对丰度（%）

3 讨论

3.1 低蛋白日粮补充Leu和Trp对哺乳犊牛直肠细菌丰富度和多样性的影响

犊牛免疫系统进化的一个主要驱动力是保持肠道微生物群落的稳态[17]。且众多研究表明，肠道微生物对肠道黏膜系统和组织发育有重要作用[18]。肠道微生物的基因库数量庞大，随着Illumina 测序技术平台的发展，用16S 高通量测序技术可以全面反映动物机体肠道微生物的菌群结构[19]。对哺乳犊牛粪便微生物OUT进行分析，其中Chao1和Observed species 指数能够反映样品中菌种丰富度，Pielou-e 指数可以反映粪便中微生物均匀度，Goods coverage则反映测序深度[20]。本试验中，LK、L、T 组和LT 组Chao1 和Observed species 指 数 低 于HK 组。T 组Chao1 和Observed species指数均高于LK组，说明降低日粮蛋白质水平补充Trp后，与LK组对比可以影响哺乳犊牛直肠菌种丰富度。本试验中，犊牛粪便微生物经PCoA分析可以发现，各组微生物结构差异较小，这说明降低日粮蛋白水质水平且补充Leu 和Trp 未对犊牛肠道微生物结构造成影响，也未对犊牛的生长发育造成不良影响。

3.2 低蛋白日粮补充Leu和Trp对哺乳犊牛粪便微生物丰度的影响

本试验直肠样品的测序条数趋近于10 000条时，曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大。从门水平上看，哺乳动物胃肠道中的两大优势菌种为厚壁菌门和拟杆菌门[23]。拟杆菌门有利于机体吸收多糖和促进蛋白质合成[21-22]，厚壁菌门有利于机体中脂质的沉积[24-25]。Durso 等[26]通过测序对肉牛的胃与肠道中细菌丰度进行了分类比较，结果表明占优势的菌门为厚壁菌门和拟杆菌门。Oliveira 等[27]对健康牛肠道不同部位进行采样，并进行了高通量测序，结果表明门水平上丰富度无显著差异，丰度较大的菌门是厚壁菌门和拟杆菌门。本试验中，优势菌门也为厚壁菌门和拟杆菌门，占比为90.03%，犊牛粪便微生物在门水平上的相对丰度均差异不显著，这可能是犊牛日龄变大，犊牛肠道微生物区系逐渐趋于稳定。

在属水平上，相对丰度较高的菌有粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和拟普雷沃菌属（Prevotella）。粪杆菌属属于厚壁菌门，是肠道中丁酸盐的生产者，丁酸盐可以调节机体抵抗外来病原体的入侵，增强肠道上皮屏障的完整性，降低动物机体炎症反应[28-29]。本试验中，L、T组和LT组粪杆菌属相对丰度高于LK组，且L 组显著高于LK 组。这可能是支链氨基酸在分解代谢过程中经氧化脱氨和脱羧产生异位酸(包括2-甲基丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)共同作用于瘤胃微生物的结果[30]。研究发现，拟杆菌属（Bacteroides）在哺乳期犊牛粪便中相对丰度较高，具有多种功能（如免疫调节和抗炎等作用）[31]。本试验中，拟杆菌属是优势菌属，各组间差异虽不显著，但在低蛋白开食料中补充Leu 和Trp 组拟杆菌属相对丰度高于LK 组，可以在一定程度上调节犊牛的免疫力，减少腹泻的发生。普雷沃氏菌属能够降解淀粉、蛋白质、纤维素、半纤维素等[32]，具有协助降解纤维的能力，本试验中，L、T、LT 组普雷沃氏菌属相对丰度高于LK组，与HK组接近，说明在低蛋白日粮中添加Leu 和Trp 可加强瘤胃细菌对纤维的消化能力，提高纤维饲料的消化率，促进瘤胃消化。拟普雷沃菌属为普雷沃氏菌科中发酵产物主要为乙酸的菌属[33]。张玉莹等[34]研究表明，正常组犊牛粪便中检测到了拟普雷沃氏菌属的存在，而腹泻组没有发现。本试验中，拟普雷沃菌属丰度较高，说明本试验中犊牛肠胃可能处于一个健康的环境。

4 结论

在低蛋白日粮中补充Leu 和Trp 对哺乳犊牛直肠微生物门属水平丰度（除粪杆菌属外）均无显著差异，说明低蛋白日粮补充Leu 和Trp 对哺乳犊牛直肠微生物影响较小，但在低蛋白日粮中补充Leu 和Trp，哺乳犊牛直肠微生物门属水平丰度可基本达到正常蛋白质营养水平丰度。