基于网络药理学和分子对接技术探讨扶正解毒方治疗社区获得性肺炎的作用机制*

贺梦雪 封继宏 吴清原 马悦宁 郭 安 张文瑞 孙增涛△

（1.天津中医药大学，天津 300000；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300000）

社区获得性肺炎（CAP）是一种感染性疾病，其主要表现为医院外罹患的感染性肺实质（含肺泡壁，即广义上的肺间质）炎症［1］。尽管现代医学研究取得了许多进展，CAP仍然是世界范围内的主要健康问题，发病率和死亡率都很高［2］。虽然抗菌药物不断地更新迭代，CAP 的治疗仍然不容乐观。传统抗生素的杀菌方式使得细菌、病毒、真菌和寄生虫等产生耐药性的速度越来越快，使感染越来越难以或不可能治疗，甚至出现抗生素耐药性。世界卫生组织宣布抗生素耐药性是全球十大公共卫生威胁之一［3］。国外有研究者［4］在抗生素耐药性和抗生素发现的新选择中提出，通过靶向宿主而不是病原体，将重点放在宿主免疫系统上，通过抑菌代替杀菌的方式有望成为解决耐药性的新方式。这与中医药多靶点、多途径、多环节的治疗理念有极大相似性，展现出了对CAP很好的治疗方向与前景。

扶正解毒方全方由小柴胡汤、麻杏甘石汤、三仁汤为主化裁而来，一则祛未解之邪，二则清未解之热，三则调不畅之气，共同发挥健脾补肺扶助正气，通腑泄热调畅气机，化湿解毒祛邪外出之功。课题前期将61 例CAP 分为试验组与对照组，试验组在常规西医治疗基础上加扶正解毒方，对照组采用西医常规治疗，试验组中医症状积分、完全退热时间、CRP降低水平均优于对照组［5］。因此本文采用网络药理学的方法探究扶正解毒方治疗CAP 的潜在作用机制，并利用分子对接技术对扶正解毒方中的有效活性成分和受体蛋白分子进行拟结合，阐述扶正解毒方多成分、多靶点、多途径的协同作用机制，为CAP 的临床治疗提供理论依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 扶正解毒方有效成分筛选及相关靶点预测 以党参、柴胡、黄芩、麻黄、杏仁、生石膏、虎杖、薏苡仁、豆蔻、半夏、甘草为关键词输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［6］，限定搜索条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，对已发布的文献进行检索，以补充相关成分的信息，并且通过使用TCMSP 来预测这些成分的作用目标。将蛋白质靶点利用UniPort 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）［7］进行矫正规范。

1.2 疾病靶点获取在疾病基因数据 GeneCards（https：//www.genecards.org）［8］（更新于2023 年3 月27日）、OMIM（https：//www.omim.org/）［9］（更新于2023 年4 月15 日）、Disgent（https：//www.disgenet.org/）中“community-acquired pneumonia”为检索词进行检索，将结果合并去重后，利用UniPort数据库进行蛋白质靶点标准化，得到CAP靶点。

1.3 药物和疾病共同靶点的筛选 将疾病靶点与药物靶点进行比对筛选，去除重复靶点，获得扶正解毒法方治疗CAP 的交集基因靶点，并通过VENNY2.1.0 平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）［10］绘制韦恩图。

1.4 “成分-靶点”网络构建 使用Cytoscape 3.9.1 构建“药物活性成分-作用靶点”网络，并且使用Network Analyzer 插件进行拓扑分析。通过预测连接度（degree）来识别关键成分。

1.5 蛋白质相互作用（PPI）网络构建 使用STRING（https：//string-db.org）［11］数据库，设定种族为智人，最小交互作用得分为0.9，导入药物与疾病交集靶基因。剔除无关网络的游离靶基因，初步得到PPI 网络图，利用Cytoscape 3.9.1 设置连接度（Degree）、紧密度（Closeness centrality）、介度（Betweenness centrality）进行PPI网络图优化，筛选核心靶点。

1.6 富集分析 使用Metascape 平台（https：//metascape.org/gp/index.html）进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。最终的可视化结果通过微生信在线平台进行展示。

1.7 分子对接 将连接度排名前5位的化合物成分及共同作用靶点进行分子对接。化合物结构通过TCMSP 平台搜索，蛋白结构通过PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）得到。使用CB-Dock 在线平台（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）通过将化合物结构和蛋白质结构导入平台的方式进行分子对接和可视化。使用对接分数来评价化合物的活性。

2 结 果

2.1 扶正解毒方活性成分及其对应靶点获取 单个中药药物活性成分利用TCMSP 平台经ADME 筛选及文献共筛选党参24 种、柴胡12 种、黄芩32 种、麻黄22 种、生石膏0 种、杏仁16 种、虎杖8 种、薏苡仁6 种、豆蔻11 种、半夏11 种、甘草87 种，其中共有成分25 种。使用Cytoscape3.9.1 软件中Network analyse进行连接度值排序，由大到小排名前5 的成分为：MOL000098、MOL000006、MOL000449、MOL000422、MOL000358。各药物对应靶点数目：党参216 个、柴胡251 个、黄芩310 个、麻黄369 个、杏仁147 种、虎杖243个、薏苡仁38 个、豆蔻255 个、半夏120 个、甘草1 106个，去除重复值后得到223个靶点。

2.2 通过GeneCards检索CAP相关靶点5 047个（选取score 值前1/4 的靶点为1 416）、OMIM 库18 个、Disgent库75个（选取score值前1/4的靶点为1 416）CAP靶点，剔除重复值后得到1 460个靶点。

2.3 收集药物和疾病之间共同靶点 将223个药物作用靶点和1 460 个疾病作用靶点录入Excel 表格，合并去重后得到113 个药物和疾病交集靶点，把药物作用的靶点和CAP 相关的靶点录入VENNY2.1.0 平台，然后绘制出韦恩图，具体结果如图1所示。

图1 药物靶点和疾病靶点交集图

2.4 化合物成分与目标蛋白靶点之间相互作用关系本药物成分网络图共包含428 个节点、3 291 条边，见图2。对于构建的成分-靶点网络，通过degree 值来评估每个节点在这个网络中的重要程度，即与该节点相互作用的节点数量。度值越高表明该节点在网络中的作用越为关键。通过degree值的统计，发现槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇等活性成分的度值较高，因此可能是扶正解毒方治疗CAP的关键成分。

图2 有效成分-靶点网络图

2.5 蛋白质相互作用PPI 网络构建 将113 个药物疾病交集基因导入STRING 数据库进行PPI网络分析，设置最小交互作用得分为0.9 分，去除无关游离基因，将上述结果导入Cytoscape 3.9.1 软件后，绘制出PPI 网络图（见图3），其中包括113 个节点和2 423 条边。在这个网络图中，degree 值较高的基因包括信号转导和转录激活因子蛋白激酶（Akt）1、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素-1β（IL-1β）等。

图3 PPI网络图

2.6 交集基因GO生物过程及KEGG通路富集分析使用Metascape 平台对113 个交集作用靶点进行了GO和KEGG 富集分析，并选取了P值排名较靠前的结果（图4～图6）。GO 富集结果显示，交集基因与对肽的反应、对脂多糖的反应、对无机物质、营养水平、调节细胞迁移、对辐射的反应、对缺氧水平的反应、凋亡信号通路的调节、外源刺激的反应以及外界刺激反应的正向调节、负向调控细胞分化、细胞死亡的正向调节、磷酸化的正向调节、生长因子反应等生物学过程。膜筏、囊泡腔、细胞外基质、Bcl-2家族蛋白复合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物、蛋白激酶复合物等分子功能关系密切。KEGG 富集结果显示扶正解毒方治疗CAP 通路主要涉及在肿瘤、脂质代谢、AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用、HIF-1 信号通路、JAK-STAT 信号通路、NF-κB 信号通路、PPAR 信号通路等几个关键通路。

图4 GO分析BP（生物过程）、CC（细胞组分）、MF（分子功能）分析图

图5 KEGG分析

图6 KEGG气泡图

2.7 分析对接验证 分别选取Dgree 值排名前5 的关键活性成分和核心靶点（及并列第5）进行分子对接验证，结果显示：关键药效物质与核心靶点的最低结合能均小于-5.0 kcal/mol（-20.9 kJ/mol），30 组中19 组结合能小于-7.0 kcal/mol（-29.3 kJ/mol），说明二者之间能够稳定的结合［12］，详见表1。对结合度排名前10 位的成分与其对应的靶点进行了可视化分析，详见图7。

表1 关键药物成分与核心靶点对接的Vina分数（kcal/mol）

图7 关键药效物质-核心靶点分子对接模式图

3 讨 论

中医并无CAP 病名，通常将其归属为“风温肺热”“外感热病”等范畴。本课题组通过前期中医证候调查发现，CAP 发生发展的关键环节与正虚有着密切联系［13］。课题组认为近代“急性虚证”理念的提出明确了外感热病中虚性病机的重要性，在外感热病的全病程中根据其病因病机的偏性而全程固护正气，是外感热病的核心治法［14］。扶正解毒方由小柴胡汤、麻杏甘石汤和三仁汤化裁而来，含党参、柴胡、黄芩、麻黄、杏仁、虎杖、薏苡仁、豆蔻、半夏、甘草等药。关于小柴胡汤证病机，《伤寒论》第97 条云“血弱气尽，腠理开，邪气因入，与正气相搏，结于胁下”，说明在机体正气不足，不能在体表抗邪外出，正邪分争之时，可与小柴胡汤祛邪以扶正。麻杏甘石汤为“温病发汗逐邪之主剂”［15］，《伤寒论》记载“发汗后……汗出而喘，无大热者，可与麻杏甘石汤”。清·俞根初在《重订通俗伤寒论·风温伤寒》中提出“为内热外寒之证者，予治甚多，重则麻杏甘石汤”“大旨以辛凉开肺为主”［16］。关于三仁汤在《温病条辨》曰“湿温病，汗之则神昏耳聋，甚则目瞑不欲言，下之则洞泄，润之则病深不解，长夏深秋冬日同法，三仁汤主之”［17］。故以此三方相合，一可祛未解之邪，二则清未解之热，三则调不畅之气，共同发挥益气补肺扶助正气、通腑泄热调畅气机、化湿解毒祛邪外出之功。

本研究利用“药物有效成分-靶点信息”网络图分析扶正解毒方中药物有关活性成分，进一步分析了两者相互作用关系。该网络图显示degree 值排名前5 位的化学成分有槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇。研究表明槲皮素具有抗菌、抗病毒、化痰止咳、神经保护、免疫调节等药理作用［18］。Lv 等［19］研究发现，小鼠在72 h 内按12 h 间隔25 mg/kg 皮下注射槲皮素，并记录肺炎链球菌所致鼻内感染模型小鼠的96 h 存活率，结果表明槲皮素能减少细胞损伤、抑制支气管肺泡灌洗液中炎症因子释放、减轻模型小鼠的肺组织病理损伤，提高被感染小鼠的存活率。槲皮素衍生物的抗炎特性可以通过抑制促炎因子的mRNA表达来证明［20］。Noh等［21］研究显示槲皮素可以通过下调CC-趋化因子受体1（CCR1）/CCR5 来缓解炎症，抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κ-B 激酶抑制剂（IκBk）和NF-κB 降解抑制剂。山柰酚可以抑制LPS 刺激的RAW 2.2 细胞的炎症因子的释放，并通过蛋白印迹等方法发现其机制可能是通过抑制NF-κB，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和Akt信号通路发挥抗炎作用［22］。木樨草素也是一种具有抗炎、抗菌和抗氧化等药理活性的天然黄酮类化合物。曲海新等［23］用气管滴注脂多糖（LPS）溶液的方法建立ARDS 模型，对照组小鼠气管滴注等量生理盐水。结果显示，木樨草素组小鼠肺组织病理损伤、炎症因子等均有所改善，其发挥作用机制可能是通过抑制ROS/TXNIP/NLRP3 信号通路激活，减轻ARDS 小鼠氧化应激与肺部炎症，改善肺损伤，修复肺功能。豆甾醇、β-谷甾醇在人体内发挥多种有益作用，包括能够发挥抗菌、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化斑块和抗衰老等作用［24-25］。吴力超等［26］通过网络药理学加细胞实验验证的方式认为豆甾醇发挥抗炎作用的机制可能是通过MAPK3 和PRKACA 等靶点发挥作用来调控雌激素信号通路。Rossi A 等［27］证明β-谷甾醇可以抑制暴露于铜绿假单胞菌的支气管上皮细胞中趋化因子IL-8的表达；在肺部慢性感染的小鼠模型中，β-谷甾醇显著减少了支气管肺泡灌洗液中的白细胞募集，并减少了气道中回收的细菌，降低了肺匀浆中参与免疫应答的关键细胞因子（主要是中性粒细胞趋化性）的表达；最终表明，β-谷甾醇有可能成为一种针对铜绿假单胞菌长期感染肺部中性粒细胞过度募集的新方向。

本研究在对“有效成分-靶点”和CAP 疾病潜在靶点的PPI 网络分析中，发现联系较高的基因有信号转导和Akt1、IL-6、TNF、VEGFA、CASP3、IL-1β。一些研究表明，Akt1 在调节细胞存活、分化和增殖、炎症反应的调节等方面发挥着广泛的作用［28］。Tang 等［29］研究表明，小鼠巨噬细胞中的Akt1 活化增强了脂多糖诱导的炎症反应。Zhao 等［30］研究表明Akt1 在调节低分子量透明质酸诱导的中性粒细胞活性中起关键作用，并且在Akt1 基因敲除小鼠的中性粒细胞积累减少表明Akt1信号传导选择性地影响炎症介质的产生。

IL-6 因其同时具有促炎与抗炎作用，被认为是一种处在自身免疫炎症十字路口的细胞因子［31］。Scheller等研究团队［32］通过对IL-6 及其相对应配体的研究，认为IL-6 经典信号传导的是再生或抗炎作用，而IL-6的反信号传导的是促炎反应。有研究认为IL-6 可以通过抑制CASP3-GSDME 介导的从细胞凋亡到焦亡的转变，抑制CASP1-GSDMD 介导的肺炎球菌性肺败血症期间的典型焦亡，预防肺巨噬细胞死亡和肺部炎症损伤［33］。TNF是免疫的中枢调节因子［34］，VEGFA 是血管发育的关键调节因子，SI 等［35］在患者中，观察到循环VEGF-A 水平升高与VAP 消退之间存在关联。通过对小鼠研究表明，VEGF-A 水平升高可能与肺部炎症消退有关。IL-1β 由多种免疫细胞类型的炎症信号诱导。过量的IL-1β 已经被证实与脓毒症患者死亡或脓毒症休克直接相关［36］。

为了说明扶正解毒方潜在靶点的生物功能和作用机制，本研究进行了GO及KEGG通路富集分析，发现潜在靶点的生物功能主要集中在对脂多糖的反应、对调节细胞迁移、对缺氧水平的反应、凋亡信号通路的调节、外源刺激的反应以及外界刺激反应的正向调节、负向调控细胞分化、细胞死亡的正向调节、磷酸化的正向调节、生长因子反应等生物学过程。对获得通路的分析发现，治疗作用靶点通路主要集中在肿瘤、脂质代谢、AGERAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、HIF-1信号通路、JAK-STAT 信号通路、NF-κB 信号通路、PPAR 信号通路等几个关键通路。其中NF-κB信号传导途径参与先天、适应性免疫和炎症反应，在机体生理、病理过程中都发挥重要作用［37］。NF-κB作为炎症反应过程中重要的转录因子，与细胞核内基因特异性结合后启动转录程序，调节细胞炎性因子的表达，参与调控多种炎症疾病发生，例如加强肺组织的炎症强度，加重肺组织的损伤［38］。NF-κB 的激活和功能受到IκB 蛋白质家族的调控；一般情况下，未被激活的NF-κB在细胞质中以p50/p65二聚体的形式存在，与抑制剂IκBα结合在一起，阻止NF-κB 的活化［39］。相关因子可诱导IκB 发生磷酸化，促使p65与特定DNA序列结合，导致靶基因的改变和激活更多炎症因子的释放与表达，进而参与肺炎过程中的肺损伤，在炎症反应过程起核心作用［40-41］。JAK/STAT 信号通路中已鉴定出50 多种细胞因子和生长因子，例如激素、干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）和集落刺激因子。JAK/STAT通路构成了一个快速的膜到细胞核信号模块，并诱导癌症和炎症的各种关键介质的表达［42］。PPAR 信号通路现在被认为是白细胞炎症反应和功能的重要调节剂，其免疫调节功能已在各种情况下进行了研究，包括肺部和中枢神经系统的细菌感染、败血症以及慢性肉芽肿病等疾病［43］。同时有研究［44］认为PPAR-γ 激动剂因其抑制炎症和增强细菌清除的能力而被建议作为细菌性肺炎的潜在辅助治疗，并且研究结果支持PPAR-γ 激动剂作为免疫调节剂治疗细菌性肺炎的临床评估。课题组前期［45-46］针对扶正解毒方对NF-κB 信号通路进行了药效学实验验证，发现扶正解毒方可以降低肺炎模型大鼠肺组织内的NF-κB p65的蛋白表达，从而抑制NF-κB通路激活，下调TNF-α、IL-10、HMGB1等炎症因子的释放。后期扶正解毒方可针对JAK-STAT 信号通路、PPAR 信号通路等进行进一步实验验证。

将扶正解毒方主要活性成分与核心靶点进行分子对接验证，结果同样表明槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇与Akt1、IL-6、TNF、VEGFA、CASP3、IL-1β结合活性较强，提示扶正解毒方的活性成分与关键蛋白具有良好的结合能力，验证了本研究结果的准确性。

综上研究结果表明，扶正解毒方的同一化学成分可调控不同的蛋白基因靶点，同一蛋白基因靶点可作用于不同的生物过程和信号通路。这一作用网络体现了扶正解毒方多成分、多靶点的协同作用特点。这为临床运用扶正解毒方治疗CAP 提供了科学依据，也为进一步挖掘扶正解毒方潜在作用机制提供了方向。限于中药化学成分在煎煮时化学反应的复杂性，未能将扶正解毒方煎煮后的化学成分以及扶正解毒方入血成分纳入分析，后续将进一步深入在具体动物或细胞实验中进行探索。

利益冲突声明：所有作者在研究过程中均无利益冲突。