补肾和脉方对老年自发性高血压大鼠下丘脑蛋白质组学的影响*

史 琳 杨传华

（山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011）

老年高血压多以收缩压升高、脉压差大、血压昼夜节律异常、易发生直立性低血压和并发症多等为特征［1］，是脑出血、脑梗死、阿尔兹海默病、心力衰竭、肾功能衰竭等最常见的基础病因，也是诱发心脑血管意外疾病的主要原因。从中医角度而言，高血压属于中医学“眩晕病”范畴，“肾虚”为老年高血压病机之本，“络脉自病”为老年高血压的病机。杨传华教授在多年的临床实践和实验研究中，总结并提出了老年高血压的病机关键在于“肾气亏虚，血脉自病”“补肾气，和血脉”的重要治疗方法，制定补肾和脉方。既往研究证实补肾和脉方可有效地降低老年高血压患者24 h 血压、脉压、脉搏波速度，明显改善左室舒张功能、大动脉弹性和功能，对老年高血压、高血压肾虚证的疗效甚佳［2-5］。本研究旨在通过观察补肾和脉方对老年自发性高血压大鼠下丘脑蛋白质组学的干预作用，探寻补肾和脉方的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级16 月龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）20只，体质量347～372 g，同月龄雄性血压正常的WKY 大鼠10 只，体质量482～502 g。SHR 和WKY 均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，经动物检验、检疫合格。动物合格证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物

补肾和脉方组成：生黄芪15 g，黄精15 g，桑寄生15 g，女贞子15 g，怀牛膝15 g，炒杜仲15 g，泽泻9 g。药材均购自山东中医药大学附属医院中药房，由医院煎药室统一煎制浓缩。

1.3 仪器及试剂

全自动大小鼠无创血压测量系统（型号：BP-300A），成都泰盟公司；96 孔型PCR 仪（型号：Arktik Thermal Cycler），美国Thermo Scientific 公司；实时荧光定量PCR 仪（型号：LightCycler 480Ⅱ），美国Roche 集团；低速自动平衡离心机（型号：ST8），美国Thermo Scientific 公司；高速冷冻离心机（型号：5424R），德国Eppendorf公司；涡旋振荡器（型号：QL-901），海门市其林贝尔仪器制造有限公司；离心机（型号：PICO17），美国Thermo Scientific 公司；超声波细胞破碎仪（型号：XO），南京先欧仪器制造有限公司；酶标仪（型号：Multiskan MK3），Thermo；恒温孵浴器（型号：HH.S4），上海浦东荣丰科学仪器有限公司；10K 超滤管（型号：PN：UFC5010BK），Milipore；高效液相色谱仪（型号：EASYnLC 1000 System），Thermo Scientic；质谱系统（型号：Q-Exactive），Thermo。RNA 提取试剂TRIzoI，美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒，M-MLV 逆转录酶，Invitrogen 公司；dNTP，OligodT，Promega 公司；2XTaq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒，编号PV 9003，北京中杉金桥生物技术有限公司；酶底物显色剂DAB 显色试剂盒；丹麦DAKO，基因科技（上海）有限公司；封闭血清，羊封闭血清原液，北京中杉金桥生物技术有限公司；Cdc42 兔多克隆抗体（型号：10155-1-AP），SIRT2 兔多克隆抗体（型号15345-1-AP），PYK2兔多克隆抗体（型号：17592-1-AP），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）ZB-2305，辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）ZB-2301，DAB 显色试剂盒ZLI-9018，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 给药方法

补肾和脉方组给予药物浓度为14.22 g/（kg·d），模型组和正常对照组给予等量生理盐水，给药容积为10 mL/kg，每天上午定时灌胃给药，每周给药6 d，连续8周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 血压 整个实验周期采用尾套式尾动脉加压法测量大鼠清醒和安静状态下的血压，包括收缩压、舒张压、脉压差、平均动脉压。

1.5.2 血清中神经肽（NPY）、去甲肾上腺素（NE）、C反应蛋白（CRP）和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ） ELISA 法检测大鼠血清中NPY、NE、CRP和AngⅡ的浓度。

1.5.3 下丘脑蛋白质组学 1）组织蛋白提取：干预结束后处死动物，取下丘脑组织，剪碎后用4℃预冷的生理盐水反复冲洗。加入适量的液氮，按照1∶10（W/V）加入样品裂解缓冲液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1%CHAPS）及蛋白酶抑制剂PMSF研磨。4 ℃，15 000 r/min，离心15 min，吸取上清，分装后，置于-80 ℃保存。2）蛋白定量（蛋白质浓度测定）：采用Bradford 法（考马斯亮蓝法）测定样本蛋白浓度。准备标准曲线，设置10个管的标准品，每孔依次加0.2 μg/μL BSA为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，补加PBS至最终体积为20 μL，各孔浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6 μg 蛋白。将样本按照说明书用裂解缓冲液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1% CHAPS）稀释至一定倍数，使终浓度落在测量范围内，稀释好的样本和标准品的每个样品各取10 μL至管中。加300 μL蛋白定量染料，避光，室温孵育20 min。595 nm测量吸光度，绘制标准曲线。依据标准曲线计算出样品浓度。3）蛋白酶解：蛋白定量后取200 μg 蛋白溶液置于离心管中，加入终浓度为25 mmol/L DTT，60 ℃反应1 h；反应后加入终浓度50 mmol/L 碘乙酰胺，室温10 min。将还原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 的超滤管中，12 000 r/min 离心20 min，弃掉收集管底部溶液。加入溶解缓冲液100 μL，12 000 r/min 离心20 min，弃掉收集管底部溶液，重复3次。更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4 μg（与蛋白质量比1∶50），体积50 μL，37 ℃反应过夜。12 000 r/min 离心20 min，将酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50 μL 溶解缓冲液，12 000 r/min再次离心20 min，与上一步合并，收集管底部共得到100 μL酶解后的样品。冻干待上样。4）钠升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析：将高PH反相分离得到的组分用20 μL 12%甲醇，0.1%甲酸复溶；12 000 r/min 离心10 min，吸取上清上样；上样体积10 μL，采取夹心法上样；Loading Pump 流速350 nL/min，15 min；分离流速300 nL/min，分离梯度见表1。

表1 分离梯度

质谱数据分析：选择SwissProt数据库，质谱分析由Thermo Q-Exactive 型质谱完成。使用Western blotting分析验证差异蛋白结果。具体步骤：12%SDS-PAGE，上样量为40 μg；电转印后，以5%脱脂奶的TBST 室温封闭1h。加入Cdc42（1∶1 000 稀释）、SIRT2（1∶500 稀释）、Ptk2b（1∶500稀释），以GAPDH 为内参，4℃孵育过夜。次日，1×TBST洗涤5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室温孵育1.5 h，1×TBST 洗涤5min×4 次。ECL显色，Fluor Chem Q下曝光、条带半定量分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血压比较

见表2。与正常对照组相比，模型组大鼠收缩压、舒张压、脉压差、平均动脉压均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，补肾和脉方组大鼠收缩压、舒张压、脉压、平均动脉压均显著下降（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

表2 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

组 别正常对照组模型组补肾和脉方组n 10 10 10收缩压122.33±1.59 193.51±1.82*164.53±1.34△舒张压76.29±2.79 133.09±1.30*112.58±0.82△脉压差45.57±1.88 60.48±1.73*52.06±1.72△平均动脉压91.86±1.94 153.19±1.20*131.21±3.49△

2.2 各组大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表达比较

见表3。与正常对照组相比，模型组大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，补肾和脉方组大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均显著下降（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表达比较（±s）

表3 各组大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表达比较（±s）

组 别正常对照组模型组补肾和脉方组n 10 10 10 NPY（pg/mL）120.01±7.37 146.66±8.74*130.06±8.34△NE（pg/mL）192.02±5.82 214.27±7.56*201.92±7.16△CRP（μg/mL）4.29±0.62 9.71±0.82*6.13±0.75△Ang Ⅱ（ng/L）142.28±5.68 188.06±8.18*166.02±6.25△

2.3 各组大鼠下丘脑蛋白质组学情况

与模型组相比，补肾和脉方组大鼠的下丘脑中共检出2 753 个差异蛋白点，其中有316 个蛋白有统计学差异（P＜0.05），其中201 个蛋白表达升高，115 个蛋白表达降低。下丘脑差异最大的前30 个蛋白为：Acan、Serpinh1、Nub1、Slc25a25、Hapln1、Syt2、Rpl23、Pvalb、Ahnak、Uqcrh、Nbas、Cpm、Ggt7、Sez6l、Aarsd1、Lgi3、Esyt1、Nefh、Ptges2、Cst3、Cdc42、Metap2、Mag、RGD1302996、Pacsin3、Epm2aip1、Tfrc、Tstd3、Coq9、Gabrg2（均为表达上调）；Dgkb、Vps51、C2cd2l、Limch1、Ptk2b、Lactb、Npy、Cpne7、Arhgap21、Cpne5、Trio、Golga2、Ccdc177、Nop56、Sarm1、Ntrk2、Sec16a、Adgrg1、Dclk1、Nup50、Chgb、Ngef、Coro2a、Rab3b、Btbd8、Zc2hc1a、Txndc12、Wfs1、Ift172、Syngap1（均为表达下调）。

2.3.1 下丘脑差异蛋白功能分析 下丘脑中差异蛋白主要集中在转运酶活性和离子通道活性方面（表4），差异蛋白主要集中在细胞质和细胞膜方面（表5）；生物学功能主要集中在代谢、磷酸化和发育方面（表6、图1）。

图1 下丘脑中差异蛋白的GO富集分析

表4 下丘脑中蛋白分子功能注释分类

表5 下丘脑中蛋白细胞定位注释分类

表6 下丘脑中蛋白生物学途径注释分类

2.3.2 下丘脑KEGG 通路分析 见表7、图2。采用DAVIA网站分析了差异蛋白在KEGG通路中的富集情况。结果如下，与模型组相比，补肾和脉方干预后的SHR 下丘脑中差异蛋白涉及的信号通路涉及cAMP 信号传导途径、GABA突触和酒精中毒通路。

图2 下丘脑中差异蛋白信号通路

表7 各组大鼠下丘脑差异蛋白的mRNA相对表达水平比较（分，±s）

表7 各组大鼠下丘脑差异蛋白的mRNA相对表达水平比较（分，±s）

组 别正常对照组模型组补肾和脉方组Cdc42 1.00±0.04 0.30±0.10*0.77±0.18△SIRT2 1.00±0.04 0.58±0.12*0.87±0.10△Ptk2b 1.00±0.09 4.13±0.16*2.16±0.45△

表7 下丘脑中差异蛋白信号通路

2.3.3 String 网络数据库建立差异蛋白互作网络 通过String 在线数据库分析差异蛋白的互作网络，具体分析结果如图3所示。

图3 下丘脑中String蛋白互作网络

2.4 各组大鼠下丘脑差异蛋白的mRNA 相对表达水平比较

见表7。与正常对照组相比，模型组大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 水平显著下降（P＜0.05），Ptk2b mRNA 相对表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，补肾和脉方组大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 相对表达水平显著升高（P＜0.05）及Ptk2b mRNA 相对表达水平均显著降低（P＜0.05）。

3 讨 论

老年高血压病的病机在于“肾虚为本，络脉自病”，肾虚为病机根本，标实为痰浊瘀血，属本虚标实之证。高血压病多起病隐匿，病程较长，“初病在气，久病在血；初病在经，久病入络”，络脉“沟通表里、渗灌气血”，而络病久、瘀、顽、杂，使得疾病迁延难愈。治疗原则应遵循“平衡阴阳，调整气血”。治法上应补益肾气，调和血脉。方中重用生黄芪为君药，“补一身之虚”，气血通畅调达，脉络自和，乃补肾和脉之首要，配合黄精、桑寄生，共奏滋肾填精、补肾通络之功。“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助，而生化无穷；善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升，而泉源不竭”，故方中臣以女贞子、炒杜仲合用以阴阳双补，平补肾之阴阳气血，使肾气充盛，怀牛膝引血下行，佐以甘寒之泽泻，补肾虚，泄肾浊，既能降湿浊，又可制约温燥诸药化热伤津、防补品滋腻恋邪之弊。纵观本方，共奏补肾益气、阴阳双补、活血行气通络之功。

下丘脑是血压调节的内分泌系统和神经系统的接口，下丘脑室旁核（PVN）是通过调节心血管、神经内分泌和其他功能来维持体内平衡的关键区域［6］。有证据支持下丘脑神经元活动的改变是导致交感神经驱动力增加和血压升高的主要因素［7］，下丘脑可以调节中枢神经元信号传导、炎症反应、氧化应激、血管紧张素分泌等过程。

本研究显示，GO功能富集分析提示下丘脑中差异蛋白主要集中在转运酶活性、离子通道活性、代谢、磷酸化和发育方面；差异蛋白主要集中分布在细胞质和细胞膜方面。采用DAVIA网站分析差异蛋白在KEGG通路中的富集情况，发现与SHR 模型组相比，补肾和脉方干预后的SHR 大鼠下丘脑中差异蛋白有关的信号通路涉及cAMP信号传导途径、GABA 突触和酒精中毒通路。cAMP 信号通路在代谢、分泌、钙稳态、肌肉收缩、细胞命运和基因转录方面具有重要的调节作用。cAMP 是最普遍和多功能的第二信使之一，cAMP 信号通路对于细胞适应复杂环境的过程非常重要，涉及多个下游信号分子家族，例如G 蛋白偶联受体（GPCRs），鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G 蛋白），腺苷酸环化酶（AC），PDE 和包括A 型激酶锚定蛋白（AKAPs）在内的支架蛋白等［8］。cAMP 在细胞中的功能主要由蛋白激酶A（cAMP 依赖的蛋白激酶EPAC）和直接由cAMP 激活的交换蛋白（cAMP 调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子cAMP-GEF）执行。cAMP 可以严密地监控包括代谢、分泌和肌肉收缩在内的多种生理病理过程，在血压的调节过程中具有重要的作用［9］。GPCRs 是cAMP 信号通路中重要的分子，是治疗高血压的重要靶标。GPCRs 通过转导激素信号改变细胞内第二信使水平、效应酶和通道活性。第二信使的降低可以抑制血管的扩张［10］。下丘脑神经元细胞通过分泌抗利尿激素，增加肾脏对水的重吸收和收缩血管，增加血压。当血压升高时，压力反射通过激活γ-氨基丁酸（GABA）抑制血管升压素神经元活动，进而降低血压。

Cdc42 编码了含191 个氨基酸、21.3 kDa 的小GTPase 蛋白质，属于Ras GTP 酶超级家族中的Rho 家族。Cdc42 参与肌动蛋白和细胞极性的调节。Cdc42与多种细胞过程密切相关，如轴突髓鞘、细胞内转运、基因转录、细胞周期调控和细胞命运的调控。Cdc42 还参与细胞迁移和趋化，主要包括巨噬细胞，T 细胞，成纤维细胞等［11］。在原发性小鼠胚胎成纤维细胞中，Cdc42 的缺失会导致异常细胞的扩散，减少对纤维蛋白的黏附，导致伤口愈合的缺陷，并随血清梯度下降其趋化性减弱［12］。有研究发现SIRT2 在神经生长和神经细胞神经活动的调节中发挥作用［13］。研究发现，AngⅡ和机械拉伸通过SIRT2 刺激内皮细胞的微管再分布和去乙酰化，在高血压诱导的血管重塑中发挥重要作用［14］。Ptk2b 与高血压密切相关。与正常血压小鼠相比，神经源性高血压小鼠下丘脑中Ptk2b 表达明显减低［15］。AngⅡ诱导的Ptk2b 磷酸化促进VSMC 增殖［16］。AngⅡ通过细胞膜上GPCR受体信号传导，激活pyk2（ptk2b），通过MAPK 信号通路，磷酸化MEK 和ERK，间接促进细胞增殖和细胞分化。大样本的高血压人群研究显示Ptk2b 与高血压相关［17］。有研究显示血管紧张素、血管收缩、钠/钾调节与Ptk2b 相关［18］。

因此，研究发现补肾和脉方对下丘脑的保护可能是通过上调Cdc42 从而促进神经元细胞活力实现的。SIRT2 可能通过抑制炎症反应和促进细胞的活力促进下丘脑组织的功能进而影响大鼠的血压。Ptk2b 可能通过改变下丘脑神经元细胞活力对下丘脑起到保护性的作用，进而延缓高血压病的发生。