抑制长链非编码RNA MALAT1对糖脂毒性诱导的内皮细胞功能障碍的影响及可能机制

张志扬 刘芬 张雪鹤 房彬彬 张冀鑫 谢骞 杨毅宁 李晓梅

目的：探讨糖脂毒性环境中抑制长链非编码RNA（lnc RNA）人类肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）的表达水平对人脐静脉内皮细胞功能影响的分子机制。

方法：用葡萄糖和棕榈酸处理人脐静脉内皮细胞，建立体外糖脂毒性内皮细胞模型，并分为对照组、高糖高脂组、高糖高脂对照组以及小干扰RNA（si-RNA）干预的高糖高脂+si-MALAT1 组、高糖高脂+si-丝裂原活化蛋白激酶1（si-MAPK1）组。应用实时荧光定量PCR 检测MALAT1、MAPK1 的mRNA 表达水平；蛋白免疫印迹法检测自噬、线粒体融合分裂、凋亡、通路相关蛋白的表达水平；免疫荧光共聚焦定位检测自噬及溶酶体相关蛋白的荧光共定位情况；透射电镜观察内皮细胞中自噬溶酶体的数目；线粒体探针染色检测线粒体形态；免疫荧光检测细胞内活性氧（ROS）的产生；流式细胞仪检测各组细胞的凋亡；细胞增殖及划痕实验检测不同时间点各组细胞的增殖及迁移能力；血管形成试验检测各组细胞中新生血管数量。

结果：与对照组相比，高糖高脂组、高糖高脂对照组的MALAT1 mRNA、磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶1（p-MAPK1）的表达水平增加，磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表达水平下降，P 均<0.05。与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组微管相关蛋白 1A/1B-轻链3（LC3）、螯合体1（p62）、ROS、剪切后活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）、BCL-2 相关X 蛋白（BAX）、p-MAPK1 的表达水平均下降，线粒体融合蛋白视神经萎缩蛋白1（OPA1）、BCL-2、p-mTOR 的表达水平均增加，P 均<0.05；LC3 和溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）蛋白的荧光共定位阳性颗粒增加（P 均<0.01），溶酶体数目减少；细胞增殖、迁移、成管能力均增加（P均<0.01）。与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MAPK1 组内皮细胞中p-MAPK1 的表达下降，p-mTOR 的表达上升（P均<0.01）。

结论：抑制MALAT1 表达，可降低糖脂毒性环境中线粒体的自噬水平，减少内皮细胞的凋亡及改善内皮细胞的功能，可能与调节MAPK1/mTOR 信号通路有关。

心血管疾病（CVD）是导致人群死亡和残疾的主要原因[1]。高血糖、高血脂是动脉粥样硬化（AS）发生发展的重要驱动因素[2]。高血糖会导致内皮细胞凋亡和自噬[3]，抑制高血糖诱导的内皮细胞自噬对内皮细胞具有保护作用[4]。血脂过高可引起低密度脂蛋白在内皮细胞下积聚，逐渐堆积成斑块导致AS[5]。“糖脂毒性”的概念最早是在胰腺β 细胞损伤中提出[6]，目前研究发现，糖脂毒性可影响内皮细胞功能，加速AS 的进程[7-8]。

长链非编码RNA（lnc RNA）是长度至少为200 bp，具有高度保守序列的非蛋白质编码RNA，其可调节内皮细胞功能，影响AS 的进展[8]。人类肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）是一种保守的lnc RNA，在内皮细胞中高度表达，与内皮细胞的增殖和血管生成等功能密切相关[9]。然而，糖脂毒性环境中MALAT1 对内皮细胞功能影响的具体机制很少研究。鉴于此，本研究探究了糖脂毒性环境中MALAT1 对内皮功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购于深圳豪地华拓生物科技有限公司；澳洲胎牛血清、DMEM 培养基购于美国Gibco 公司；活性氧（ROS）试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；CCK8 试剂盒购于北京博奥森生物科技有限公司；E 偶联膜联蛋白V（Annexin-V）凋亡检测试剂盒购于美国BD 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购于美国Thermo 公司；微管相关蛋白 1A/1B-轻链3（LC3）、螯合体1（p62）、苄氯素1（Beclin1）一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司；BCL-2 相关X蛋白（BAX）、BCL-2 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、线粒体融合蛋白视神经萎缩蛋白1（OPA1）、动力相关蛋白（Drp1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、磷酸化MAPK1（p-MAPK1）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗购于美国Cell Signaling Technology 公司。羊抗兔/羊抗鼠 IgG-HRP 二抗购于北京博奥森生物科技有限公司。

1.2 方法

细胞培养、细胞模型制作及分组：HUVEC 培养在含有5%胎牛血清、1%抗生素的DMEM 完全培养基中，每隔2 天换液1 次，在细胞密度达95%左右时，按照1:2 的比例进行细胞传代处理。在细胞密度达80%左右时加入终浓度为30 mmol/L 葡萄糖、500 μmol/L 棕榈酸培养24 h，制备体外高糖高脂处理细胞模型；在细胞密度达70%左右时提前给予小干扰RNA（si-RNA）处理，6 h 后更换为含抗生素的完全培养基，24 h 后加入高糖高脂培养基，培养24 h制备高糖高脂si-RNA 干预细胞模型。将不同处理的HUVEC 分为对照组、高糖高脂组、高糖高脂对照组以及经si-RNA 干预的高糖高脂+si-MALAT1 组、高糖高脂+si-MAPK1 组。

细胞内MALAT1 表达及活性氧（ROS）的测定：用TRIzol 试剂法提取细胞总RNA，测定其浓度和纯度；逆转录合成互补DNA；严格按说明书配置逆转录聚合酶体系；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）扩增体系相同[10]，每组3 个副孔。引物序列见表1。ROS 检测[7]：在24 孔板中进行爬片后，严格按ROS试剂盒说明书测定各组ROS 含量并在荧光显微镜下观察并拍照。

表1 引物序列

自噬蛋白LC3、溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）共聚焦定位[7]：在24 孔板中根据不同分组进行细胞处理，每组3 个复孔。各组细胞干预结束后，多聚甲醛固定爬片；室温封闭；孵育一抗（LC3、LAMP2）；孵育相应种属荧光标记的荧光二抗，避光孵育，对标本进行染核；封片后在荧光显微镜下观察；随后进行激光共聚焦荧光检测。透射电镜观察溶酶体数目[7]：收集细胞，固定保存。离心洗涤后加入1%琼脂糖溶液，1%锇酸避光室温固定，脱水，包埋过夜，聚合，切片，染色过夜后在透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

线粒体荧光探针法检测线粒体动力学功能：在24 孔板中进行爬片计数，根据不同分组进行细胞处理，每组3 个复孔。各组细胞干预结束后，多聚甲醛固定爬片，孵育，染核，封片，然后在荧光显微镜/共聚焦显微镜下观察采集图像[11]。

流式细胞术检测细胞凋亡：收集处理后的各组细胞，严格按照E 偶联Annexin-V 凋亡检测试剂盒操作，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率[12]。

CCK-8 检测细胞存活率[12]：将细胞接种到96孔板中，按照上述方法分别处理各组细胞，每组3个复孔；干预结束后，分别于0、24、48、72 h 进行转染；每孔加入10 μl CCK-8 溶液，37℃孵箱孵育2 h，用紫外分光光度计测各组在540 nm 处的吸光度。

伤口愈合实验检测迁移能力[12]：细胞计数后6孔板铺板，每组3 个复孔；24 h 后细胞划痕，按照上述方法分别处理各组细胞放入培养箱培养。分别于0 、24、48 h 在高倍显微镜下观察细胞迁移情况。

血管化实验检测成管能力[12]：细胞计数后6 孔板铺板，每组3 个复孔；处理各组细胞，在血管生成载玻片每个孔中加入10 μl 基质胶后放入培养箱中使胶凝固；每孔加入50 μl 细胞悬液；培养箱培养2 h 后开始观察，并在适当时间点拍照记录实验结果。

蛋白免疫印迹法检测自噬、线粒体融合分裂、凋亡、通路相关蛋白的表达水平：各组细胞干预结束后，使用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。配制蛋白上样体系；配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶，蛋白上样20 μg，电泳结束后将蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，Tris 缓冲盐溶液+0.1% Tween 20（pH7.4，TBST）溶液洗膜3 遍，5%脱脂牛奶封闭2 h，再次洗膜3遍后，裁剪PVDF膜，分别放置在相应稀释好的一抗中，4℃孵育过夜，洗膜3 遍后，二抗孵育1 h，漂洗3 遍后，进行电化学发光法（ECL）显影。利用Image J 软件进行灰度分析，以GAPDH 作为内参照计算各组蛋白的相对表达量。

统计学方法：所有统计分析均使用SPSS 22.0 软件进行。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用SNK 法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制MALAT1 表达后糖脂毒性环境下内皮细胞中的线粒体自噬情况（图1）

图1 抑制MALAT1 表达后糖脂毒性环境下内皮细胞中的线粒体自噬情况（x±s,n=3）

RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，高糖高脂组、高糖高脂对照组MALAT1 mRNA 表达水平升高（P均<0.001）；与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组MALAT1 mRNA 的表达水平明显降低（P<0.001），见图1A。蛋白免疫印迹法结果显示，与对照组比较，高糖高脂组、高糖高脂对照组自噬激活的特异性标志物LC3、p62 表达增加（P均<0.05），Beclin1 表达下降（P均<0.01），见图1B。荧光共定位情况结果显示，与对照组比较，高糖高脂组、高糖高脂对照组中LC3 和LAMP2 蛋白的荧光共定位阳性颗粒增加（P均<0.01）；与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组中LC3、LAMP2 阳性颗粒减少（P均<0.01），见图1C。透射电子显微镜观察结果显示，与对照组比较，高糖高脂组、高糖高脂对照组内皮细胞中溶酶体数目增加；与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组中溶酶体数目减少，见图1D。

2.2 抑制MALAT1 表达对糖脂毒性引起的内皮细胞氧化应激与线粒体动力学功能障碍的影响（图2）

ROS 荧光探针检测与蛋白免疫印迹法结果显示，与对照组比较，高糖高脂组、高糖高脂对照组ROS、线粒体分裂蛋白Drp1 的表达水平均增加（P均<0.05），细胞内线粒体裂变增多，表现为线粒体碎片化，抑制MALAT1 表达后细胞内的线粒体裂变减少，融合增多。与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组细胞ROS 表达下降，线粒体融合蛋白OPA1 表达水平增高（P均<0.05）。

2.3 抑制MALAT1对糖脂毒性导致的人脐静脉内皮细胞凋亡水平的影响（图3）

与对照组相比，高糖高脂组、高糖高脂对照组中细胞凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表达均增加，BCL-2 表达减少（P均<0.01）；与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表达均下降，BCL-2表达增加（P均<0.05），见图3A、3B。

2.4 抑制MALAT1 表达对糖脂毒性导致的人脐静脉内细胞增殖、迁移、成管功能障碍的影响（图4）

图4 抑制MALAT1 表达对糖脂毒性导致的人脐静脉内细胞增殖、迁移、成管功能障碍的影响（x±s,n=3）

与对照组相比，高糖高脂组、高糖高脂对照组内皮细胞增殖、迁移、成管能力均下降（P均<0.01）；与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组细胞增殖、迁移、成管功能均上升（P均<0.01），见图4A～C。

2.5 糖脂毒性条件下MALAT1 对内皮细胞中MAPK1/mTOR 信号通路相关蛋白的mRNA 及蛋白表达水平的影响（图5）

图5 糖脂毒性条件下MALAT1 对内皮细胞中MAPK1/mTOR 信号通路相关蛋白的mRNA 及蛋白表达水平的影响（x±s,n=3）

RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，高糖高脂组、高糖高脂对照组内皮细胞中MAPK1 mRNA 表达水平升高（P<0.001），见图5A；蛋白免疫印迹法显示，与高糖高脂对照组相比，高糖高脂+si-MALAT1 组p-MAPK1 表达水平降低（P<0.05），p-mTOR 表达水平上升（P<0.01），见图5B；高糖高脂+si-MAPK1 组p-MAPK1 表达水平降低（P<0.01），p-mTOR 的表达水平升高（P<0.01），见图5C。

3 讨论

AS 是一种慢性炎症疾病，其主要特征是斑块的形成。斑块表面由内皮细胞、纤维细胞等组成的“纤维帽”成分覆盖，内部含有脂质和（或）坏死核心[13]。内皮细胞的自噬、凋亡和损伤均会导致内皮屏障减弱、脂质积累和粘附蛋白积累，这些都是AS的早期事件。因此，内皮细胞功能受损在AS 的发生发展过程中起着重要作用[14]。

自噬可利用溶酶体自我消化降解那些功能受损的细胞器和蛋白质[15]，为细胞生存提供能量代谢前体并维持细胞稳态，因此自噬的启动与溶酶体活性的变化密切相关[16]。细胞氧化应激时会积累受损或有毒的蛋白质和细胞器，从而激活自噬以维持细胞稳态[17]。然而，细胞内自噬的过度激活会导致自噬流受损，并诱导细胞凋亡[18]和功能受损。

线粒体自噬（mitophagy）是细胞内一种重要的选择性自噬，在细胞受到有害因子刺激后可维持细胞正常的功能状态，减少内皮细胞中ROS 的产生，从而缓解AS 的进展[19]。据报道，线粒体自噬的活化是在ROS 生成增加的条件下被激活的[20]，这说明ROS 的增加不仅能诱导线粒体自噬的活化，且线粒体自噬活性被上调的程度与ROS 含量呈正相关[21]。且有研究表明，线粒体动力学可调节线粒体自噬[22]。本研究结果显示，在高糖高脂环境下，内皮细胞中ROS 含量增加，线粒体动力学功能障碍，自噬相关蛋白Beclin1、p62、LC3 表达结果，免疫荧光线粒体自噬特异性蛋白LC3、LAMP2 共聚焦结果、透射电镜采集内皮细胞中溶酶体数目结果均显示内皮细胞自噬被激活。其中作为自噬的底物，p62 被运送到溶酶体进行降解，而暴露于糖脂毒性后p62 的表达增加可能与自噬体的不连续更新有关[23]。所有这些证据表明，干预内皮细胞自噬是治疗冠心病的一种有前途的新策略。

研究发现，MALAT1 在冠心病血液样品中的表达显著上调[24]。这表明，MALAT1 可能作为AS 的潜在生物标志物，加速了冠心病进展[25]。MAPK1也称为ERK2、p42MAPK，在细胞增殖、分化、转录调节和发育中起着至关重要的作用[26]。据报道，MAPK1 与MALAT1 的表达正相关[27]，MALATI 可以激活MAPK1 信号通路[28]。本研究RT-qPCR 的结果显示，MALAT1 和MAPK1 在高糖高脂环境下的内皮细胞中表达显著上调，在给予si-MALAT1 后MAPK1 的表达下降，与上述研究结果相符。

mTOR 作为在自噬中发挥作用的关键调节因子，被抑制后可激活自噬[29]。研究显示，在冠心病中mTOR 信号通路被激活[24]，其调节自噬的过程中受MAPK 的调节[30]。因此，研究MAPK1/mTOR 信号通路调控自噬对AS 治疗具有重要意义。本研究蛋白免疫印迹结果显示，内皮细胞中MAPK1 表达显著增高，mTOR 表达显著下降，与上述研究结果相符。

为了确定MALAT1 是否可以激活mTOR 信号，首先通过RT-qPCR 在不同分组中检测MALAT1 和MAPK1 的表达水平，发现MALAT1 和MAPK1 的表达在高糖高脂环境下的内皮细胞中高表达且呈正相关，再通过蛋白质免疫印迹在不同条件下检测上游调节剂MAPK1（ERK1/2），发现MALAT1/MAPK1影响mTOR 信号传导以介导细胞自噬，并进一步影响冠心病进展。结果表明，MALAT1 通过调节MAPK1 触发mTOR 信号通路。

本研究发现当高糖高脂刺激HUVEC 时，内皮细胞中MALAT1表达升高激活内皮细胞线粒体自噬，导致内皮细胞凋亡与细胞功能障碍，加速AS 进程。在给予si-MALAT1 干扰后，MAPK1 表达下降及mTOR 表达上升，内皮细胞功能得到改善。

综上所述，本研究认为糖脂毒性环境下lncRNA MALAT1 诱导内皮细胞线粒体自噬，内皮细胞凋亡与功能障碍，可能与调节MAPK1/mTOR 信号通路有关。抑制MALAT1 表达后，可改善内皮细胞功能，为临床上进一步治疗AS 提供了新思路。然而，本研究有局限性，未设计动物实验进行验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突