3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林Cu(II)和Zn(II)配合物的合成、晶体结构及抗肿瘤活性研究

王佳乐,苏 武,田文豪,张梦瑶,陆飘飘,李文戈

(蚌埠医科大学公共基础学院,安徽 蚌埠 233030)

席夫碱是一类稳定的亚胺化合物,最初是由德国科学家雨果·希夫在1864年报道[1],是由羰基和伯胺化合物通过亲核加成、重排和脱水反应而形成的配位化合物[2]。亚胺或亚甲基在自然界中广泛地存在,其多存在于各种天然化合物、天然衍生化合物和非天然化合物中。吡唑啉酮类是生物学、立体化学、药理学、临床以及分析应用的优良试剂。4-氨基安替比林是吡唑啉酮一个重要的衍生物[3-4],具有广泛的生物活性。由于4-氨基安替比林衍生物分子中羰基和亚胺键的存在,容易发生配位,其常被用于配位化学中,是潜在的优良配体,并能够与金属离子形配合物[5],从而形成了性能各异的席夫碱金属配合物,在制药行业中已经得到了广泛的应用[6-7]。

研究表明,4-氨基安替比林衍生物及金属配合物对细菌、肿瘤、真菌均有很好的抑制作用[8-10],ROSUNT等[11]报道了4-氨基-2,3-二甲基-1-苯基-3-吡唑啉-5-酮配体的Cu(II)配合物对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼假杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和念珠菌的生物活性,结果显示对大肠杆菌和鲍曼假杆菌表现出高杀菌活性。JOSEYPHUS等[12]研究了咪唑-2-甲醛缩-4-氨基安替比林配体及其Co(II)、Ni(II)、Cu(II)和Zn(II)配合物对HeLa(人类宫颈癌细胞)和HCT116(结肠癌细胞)体外抗肿瘤活性研究,结果表明对HCT116细胞和HeLa细胞表现出有效的抑制作用。张淼[13]利用1-苯基-3-甲基-4-乙酰基-5-吡唑啉酮、1-苯基-3-甲基-4-甲酰-5-C1-吡唑和苯甲酰丙酮与4-氨基安替比林席夫碱合成了三种新型芳基吡唑酮缩-4-氨基安替比林希夫碱并研究其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抗菌活性,结果显示其对大肠杆菌和枯草杆菌具有较高抑菌活性。

综上所述,新型4-氨基安替比林席夫碱配合物具有较好的生物活性,探索抗癌活性好的4-氨基安替比林席夫碱配合物一直是药物工作者的研究热点。本文通过采用3,5-二氯水杨醛与4-氨基安替比林合成一个新型的3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林配体,再设法将3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林配体与金属离子利用溶剂热反应合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林金属配合物,利用X单晶衍射分析配合物的结构,并利用MTT法探究3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林配体及金属配合物在体外抗肿瘤的活性。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

3,5-二氯水杨醛、4-氨基安替比林(均为化学纯,国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(苏州嘉鼎化学科技有限公司)、三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、CuCl2·2H2O、Zn(Ac)2·2H2O(均为苏州嘉鼎化学科技有限公司)、DMSO(山东捷世康)均为市售分析纯;MTT体外抗肿瘤活性实验使用的试剂和仪器是顺铂(MCE)、胎牛血清(南京维森特生物技术有限公司)、MTT(江苏艾菱菲生物)、6孔和96孔培养板(均为上海一斗生物科技有限公司)、胰蛋白酶(Gibco)、PBS溶液(普诺赛)、人肺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE-2Z细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞(均为中国科学院上海细胞库)。

X射线单晶衍射仪D8 Quest(Bruker Apex Smart Apex II);粉末衍射仪Bruker D8(丹东浩元仪器有限公司);红外光谱仪Nicolet(Thermo Scientific);热重分析仪STA449-F5分析仪(Thermo Scientific)。

1.2 配体(HL)、配合物1和2的合成路线

利用3,5-二氯水杨醛与4-氨基安替比林,通过缩合反应合成3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林配体,再将3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林配体与金属Cu(II)、Zn(II)离子利用溶剂热反应合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林金属配合物1和配合物2。图1为配体(HL)、配合物1和配合物2的合成路线。

图1 配体(HL)、配合物1和2的合成路线

1.3 席夫碱配体(HL)的合成

精确称取4-氨基安替比林(1.50 g, 7.38 mmol)加入无水乙醇(20 mL)三颈烧瓶(250 mL)中,搅拌溶解,再将精确称取的3,5-二氯水杨醛(1.41 g, 7.42 mmol)完全溶解于40 mL无水乙醇,将其逐滴加入三颈烧瓶中回流5 h。反应完成后,三颈烧瓶底部有黄色沉淀生成,冷却至室温,将得到的产物进行减压抽滤得到席夫碱配体粗品,再用无水乙醇洗涤2～3次,常温下干燥,最终得到淡黄色粉末状3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林,配体的化学式为C18H15O2N3Cl2(产率:83 %)。

1.4 配合物[CuL2](配合物1)的合成

精确称取席夫碱配体3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林(0.01 g, 0.026 6 mmol)和CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol)溶解于8 mL无水乙醇液中,最后加入三乙胺调节pH为8.7,混合均匀,将溶液转移至体积为20 mL的内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中,放入烘箱,在67 ℃反应72 h后,自然冷却至室温,在反应瓶底部有墨绿色晶体生成,经过滤、洗涤得到墨绿色产品(产率:57%)。

1.5 配合物[ZnL2](配合物2)的合成

Zn(II)配合物的合成方法与Cu(II)合成采用类似的方法,不同的是需溶解于无水乙醇(8 mL),三乙胺调节pH为7.2,用Zn(Ac)2·2H2O(0.01 g,0.045 6 mmol)代替了CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol),在65 ℃反应72 h,得到黄色棒状晶体(产率:52 %)。

1.6 X-单晶晶体结构分析

选取配体(HL)、配合物1和配合物2,外观较好、尺寸合适的晶体用于结构解析。单晶的X射线衍射数据在160 K和173 K条件下,用经过石墨单色器化的MoKα射线(λ=0.710 73 Å)[14],通过单晶X衍射射线测定晶体结构,在Siemens Smart CCD衍射仪上收取,并分别使用SHELXS-97[15]和SHELXL-97[16]软件进行结构的求解和细化。表1列出了配体(HL)、配合物1和配合物2的晶体参数。

表1 配体(HL)、配合物1和配合物2的晶体学参数

1.7 配体HL、配合物1和配合物2的抗肿瘤活性实验

使用MTT法[17]测定三种人肿瘤细胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549的增殖,将细胞在37 ℃、5% CO2下,以每孔4×103个细胞在96孔板中培养24 h,去除培养基,使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞,然后将用DMSO(1%)配制好的席夫碱配体HL、配合物1和配合物2溶液(5 mmol/L),以50、25、12.5、6.25、0 μmol/L的浓度每孔100 μL接种到96孔板,将只含DMSO(1%)不含细胞的作为对照组,37 ℃、5% CO2下条件下培养,72 h后,每孔加入10 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL),继续培养4 h后,使用微板读取器在490 nm波长下测量OD值。每样本浓度重复5个孔,取平均值计算抑制率和IC50值。

2 结果与讨论

2.1 HL的分子结构

由X射线单晶衍射分析表明,配体3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林(HL)是单斜晶系,属于P21/n空间群。分子结构如图2所示,3,5-二氯水杨醛通过亚胺键与4-氨基安替比林键合,4-氨基安替比林的吡唑环与3,5-二氯水杨醛的苯环几乎共平面。

图2 HL的分子结构

配体分子堆积如图3所示,在配体(HL)分子中存在两种C—H…Π相互作用。配体中4-氨基安替比林苯环几乎垂直于另一相邻的配体的4-氨基安替比林苯环,4-氨基安替比林苯环上的H17与另一相邻分子4-氨基安替比林苯环形成C—H…Π堆积(距离:0.353 69 nm)。配体的3,5-二氯水杨醛苯环几乎平行于另一相邻的4-氨基安替比林吡唑环,3,5-二氯水杨醛苯环上H2与相邻吡唑环形成C—H…Π堆积(距离:0.390 03 nm),最终配体分子通过C—H…Π相互作用堆积形成三维空间结构。

图3 配体HL的分子通过C—H…Π堆积相互连接(虚线)

2.2 配合物1的晶体结构

配合物1是单核配合物,属于单斜晶系,空间群为P21/c(表1),图4是配合物1的分子结构图,配合物1分子对称单元由一个Cu(II)原子和两个分子去质子配体(L-)组成。表2和表3分别列出了配合物1的部分键长和键角。每个Cu(II)离子由两个O原子(O1,O1′来自配体的3,5-二氯水杨醛羟基O原子)、两个N原子(N1,N1′来自配体的亚胺键的N原子)。中心离子Cu(II)的与配位原子间的键角O1—Cu1—N1、O1—Cu1—N1′、O1—Cu1—O′、N1—Cu1—O1′、N1′—Cu1—O1′、N1—Cu1—N1′分别对应90.717(9)°、93.640(9)°、154.548(9)°、93.640(9)°、90.717(9)°、160.132(10)°。因此,配合物1的中心离子Cu(II)形成轻微扭曲的四配位的四方形构型。

表2 配合物1和配合物2的部分键长

表3 配合物1和配合物2的部分键角

图4 配合物1的阳离子分子结构

图5是配合物1的分子堆积图,配合物中3,5-二氯水杨醛的苯环与另一相邻分子4-氨基安替比林的苯环几乎垂直,3,5-二氯水杨醛苯环上的H6与4-氨基安替比林的苯环形成C—H…Π堆积(距离:0.342 69 nm)。最终,离散的单体配合物1分子通过C—H…Π相互作用堆积形成三维空间结构。

图5 配合物1的分子通过C—H…Π堆积相互连接(虚线)

2.3 配合物2的晶体结构

配合物2是单核配合物,属于单斜晶系,空间群为P21/c(表1),图6是配合物2的分子结构图,图7是配合物2的分子堆积图。配合物2分子单元由一个Zn(II)原子、两个去质子配体(L-)组成。每个Zn(II)离子由四个O原子配位(O1、O3来自配体的3,5-二氯水杨醛酚羟基O原子,O2、O4来自配体的4-氨基安替比林羰基O原子)和两个N原子配位(N1、N4来自配体的亚氨基N原子)组成。中心离子Zn(II)的配位原子间的键角在84.356(8)°到170.046(10)°之间,因此,配合物2形成了六配位的扭曲的八面体构型[18-21]。

图6 配合物2的阳离子分子结构

图7 配合物2的分子通过Π…Π堆积相互连接(虚线)

如图7所示,配体的4-氨基安替比林的苯环几乎平行于另一相邻分子的4-氨基安替比林苯环,形成了面到面的Π…Π堆积(距离:0.384 21 nm),最终,配合物2分子通过Π…Π相互作用堆积形成3D空间结构。

2.4 红外光谱

由图8可知,配合物1和配合物2在1 441～1 552 cm-1范围内有吸收峰,主要归因于亚胺键的伸缩振动,相对于配体(HL)而言出现了红移。配合物1和2在550～581 cm-1范围内有新的吸收峰,主要归因于N、O原子与金属形成了配位键[22],证实了配体(HL)中的N、O原子分别与金属形成了配位键,结果表明,红外分析结果与配体(HL)、配合物1和配合物2的分子结构一致。

(a)配体HL (b)配合物1 (c)配合物2图8 化合物的红外光谱

2.5 X射线粉末衍射图

在室温下,采用粉末X射线衍射(PXRD)[23]验证配合物1、配合物2的结构,如图9所示,合成的配合物1和配合物2样品的X射线上的衍射数据与单晶X射线衍射结构解析数据模拟进行对比,得到的衍射峰在强度和位置上完全一致,表明合成的配合物的晶体样品的分子结构与单晶测定的分子结构相同。

(a)配合物1 (b)配合物2图9 配合物1和配合物2的PXRD图谱

2.6 热重分析

对配合物1和配合物2的热稳定性进行研究,如图10所示,TGA分析表明,配合物1具有较高的热稳定性,在260 ℃下质量几乎没有损失,在260～540 ℃范围内质量急剧下降,失重率为44.62%,相当于失去一个3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林希夫碱配体分子(计算值为45.98%),700 ℃后整个分子框架持续分解。配合物2也具有较高的热稳定性,低于265.45 ℃,质量几乎没有损失,在265.45～550 ℃范围内也出现质量急剧下降现象,失重率为44.57%,相当于失去一个3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林希夫碱配体分子(计算值:45.87%),高于700 ℃,整个分子框架持续坍塌。

图10 化合物的热重分析TG(A)-DSC(B)

2.7 抗肿瘤活性

使用MTT方法对三种人肿瘤细胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549进行体外评估细胞毒性,检测其48 h后对三种癌细胞活性的影响,计算配体(HL)、配合物1和配合物2的IC50值[24]。由表4可以得到,配体(HL)、配合物1和配合物2对三种癌细胞都具有一定的活性,配合物对癌细胞的抑制作用普遍比配体好,配合物1对MDA-MB-231细胞和CNE-2Z细胞抗增殖活性最好,IC50值分别为(1.215±0.07) μmol/L、(4.417±0.28) μmol/L均低于顺铂的IC50值,说明配合物1对MDA-MB-231癌细胞和CNE-2Z癌细胞具有较强的抑制增殖能力。配合物2对A-549细胞和MDA-MB-231细胞IC50值分别为(96.37±12.78) μmol/L、(43.26±6.12) μmol/L,也显示出较好的抑制癌细胞生长的效果。以上实验数据表明,配合物对癌细胞的IC50都比配体的IC50低,证明引入Cu(II)、Zn(II)金属离子增加了配体的抗肿瘤活性,其中配合物1比顺铂更有效地抑制MDA-MB-231和CNE-2Z癌细胞的增殖。

表4 配体HL、配合物1和配合物2对3种人肿瘤细胞株体外IC50值

3 结论

目前GHORAB等[25]研究了利用4-氨基安替比林合成了吡唑、吡咯、嘧啶和吡唑嘧啶的新型氨基安替比林衍生物并对人体乳腺癌细胞体外抗肿瘤活性研究,结果表明,具有磺酰胺结构的部分新型吡唑类希夫碱对人体乳腺癌细胞具有良好的体外抗肿瘤活性,但未明确其准确的配合物分子结构。本文利用3,5-二氯水杨醛与4-氨基安替比林,通过缩合反应,合成3,5-二氯水杨醛缩-4-氨基安替比林希夫碱配体(HL),利用溶剂热反应合成了配合物1和配合物2,并用X射线单晶衍射确定配体(HL)、配合物1和配合物2的分子结构,其中配合物1是四配位的四方形构型的单核配合物,配合物2是六配位的八面体构型的单核配合物,通过MTT法测定了配体(HL)、配合物1和配合物2,对3种人肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性,结果显示,配合物1对MDA-MB-231癌细胞和CNE-2Z癌细胞具有较强的抑制增殖能力,且IC50值均低于顺铂的IC50值,为抗癌药物的研发开辟了新的途径。