一株猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的分离鉴定及攻毒模型建立

王璐瑶,谢红玲,闵娟娟,李晶梅,刘项羽,王明哲,王碧群,李婷婷,冯 钊,石宝兰,漆世华,张栋梁

(国药集团动物保健股份有限公司,武汉 430075)

猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus typeⅠ, FHV-1)属于疱疹病毒科的疱疹病毒亚科[1]。自1958年Crandell和Maurer从患有上呼吸道疾病的猫中首次分离出FHV-1以来[2],FHV-1分布于世界各地,在临床上是最重要的猫呼吸道感染病原体[3]。由FHV-1引起的猫病毒性鼻气管炎是一种典型的急性、发热、传染性疾病,其特征在于打喷嚏并伴有眼和鼻分泌物。通常的潜伏期为2～4 d,有时更长。这种感染对于小猫或存在免疫系统疾病的猫死亡率较高,成年健康猫大多数在7～10 d内恢复,但会表现出终生潜伏期[4-5]。迄今为止开发的疫苗都没有能够在防止再次感染时病毒复制方面提供完全保护[6-8]。本研究将患急性上呼吸道疾病的猫鼻分泌物接种猫肾细胞,并进行连续传代,将获得的细胞培养物通过分子生物学的方法、透射电镜观察和猫攻毒实验的鉴定,证实该分离株为FHV-1,为开展猫病毒性鼻气管炎的诊断及疫苗的研发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病料、细胞和实验动物 眼、鼻拭子样品取自武汉市某猫舍病猫,经临床诊断和RT-PCR检测猫疱疹病毒阳性。同时该病猫经试纸条和RT-PCR检测猫杯状病毒(FCV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)阴性。猫肾细胞系(F81)由国药集团动物保健股份有限公司保存。2～3月龄健康蓝猫购自北京伟特博瑞鼎生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基、0.25%Trypsin-EDTA购自Gibco公司、胎牛血清(FBS)购自内蒙古奥普赛公司;2×Taq Plus Master MixⅡ (Dye Plus)购自Vazyme公司;FHV-1猫源阳性样品由国药集团动物保健股份有限公司保存;PCR仪购自博日科技有限公司;DYY-7C 电泳仪电源购自北京六一生物科技有限公司;倒置显微镜购自德国蔡司ZEISS公司。

1.3 病毒的分离纯化与病变观察 将患病猫的眼鼻分泌物病料浸泡在PBS溶液中并通过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后,按照5%体积比接种于F81细胞中,并使用2%新生牛血清的DMEM培养基继续培养3～6 d,逐日观察有无细胞病变。培养物在细胞单层上连续盲传3代,如不出现病变则弃去。若出现细胞病变则分离结果为阳性,将有80% CPE的细胞培养物按常规方法进行空斑纯化3次。收获的细胞培养物冻融2次,-70 ℃保存。

1.4 病毒的PCR鉴定 使用Multisource Genomic DNA/RNA Miniprep Kit (Axygen, Hangzhou, China)从1.3项获得的纯化后病毒液提取病毒基因组DNA,选择FHV-1 gD基因的保守区域[9-10],利用DNAMAN软件设计1对检测FHV-1的特异性引物。上游引物: 5’- TCCGTCTAATGATGACACGTC-3’;下游引物: 5’-GAATGTGGACTTAAGGATG-3’。PCR反应采用50 μL反应体系,提取的DNA产物2 μL,10×Taq酶buffer(Mg2+plus)(20 mmol/L) 5 μL、引物F(10 μmol/L)1 μL、引物R(10 μmol/L)1 μL及dNTP Mix(2.5 mmol/L)4 μL,加无菌水36.75 μL,加TaKaRa Taq DNA聚合酶0.25 μL(5 U/μL)混匀,反应条件为98 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,30个循环后72 ℃延伸10 min,反应结束。以1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.5 PCR产物的克隆和序列测定 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,使用大连宝生物公司的胶回收试剂盒进行回收,回收的片段在武汉擎科生物有限公司进行序列测定。将测序结果提交GenBank进行比对分析。使用MEGA-5软件进行同源性分析。

1.6 病毒的形态学观察 将1.3项收获的纯化后病毒液上清30000 r/min在4 ℃条件下进行超速离心5 h,离心后沉淀使用少量PBS进行复溶,取25 μL复溶样品与2.5%醋酸铀染液滴于封口膜上,将有支持膜的铜网先置于样品滴上,3～5 min后用镊子夹起,用干净三角形滤纸片从铜网边缘轻轻吸去液体,将稍干的铜网置于染液上染色3 min,以同样的方法使用滤纸吸去染液,将制备好的铜网在JM-100CX透射电镜下观察病毒形态并拍照。

1.7 攻毒实验 选择6只健康蓝猫,中和实验检测无FHV-1/FCV/FPV抗体,2～3月龄,体重1.8～2.0 kg,随机分为两组,通过常规病毒含量检测的方法[19]确定分离株F4代细胞培养物的病毒含量,适当稀释后,实验组三只猫通过滴鼻点眼的途径接种含有107.0TCID50/mL的分离株1 mL/猫,对照组三只猫相同的接种方式接种PBS。由于FHV-1的传播主要是通过与感染动物的直接接触,实验组和对照组分别饲养在不同地方,避免交叉。每天测量每只猫的体温,并观察临床症状。接种后第3 d开始收集鼻、眼、咽喉分泌物进行PCR检测。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离培养 在接种病料72 h后,F81细胞表现出明显疱疹病毒感染后的细胞病变,其特征主要为细胞变圆、圆缩,部分细胞出现坏死脱落呈现空斑状,96 h时贴壁细胞剩约10%。空斑纯化3次后的病毒液以2%比例继续在F81细胞上进行传代,通过观察发现病毒在48 h～72 h出现疱疹病毒典型CPE,而对照的F81细胞未出现CPE(图1)。

2.2 病毒的鉴定

2.2.1 病毒PCR检测及同源性分析 使用FHV-1的特异性引物,对FHV-1每一轮空斑纯化后克隆毒株进行PCR鉴定,显示均为 FHV-1 阳性,扩增片段约1125 bp,与预期gD基因大小相符合(图2)。将成功分离的FHV-1命名为WHFHV05株。gD基因的测序结果通过MEGA-5软件比对分析发现,与GenBank上美国典型毒株C27(FJ478159.2)、澳大利亚分离毒株(KR381802.1、KR381788.1)、中国黑龙江分离株(MH027311.1)、美国MILW_12、PHIL_01毒株(MH070338.1、MH070336.1)和英国CH-B毒株(MT813047.1)的同源性均为100%,说明分离株WHFHV05的基因保守性良好(图3)。

图3 WHFHV05株gD基因同源性分析Fig 3 Homology analysis of gD gene of WHFHV05 strain

2.2.2 WHFHV05株病毒颗粒电镜观察 超速离心收获的细胞培养物通过电镜观察,发现病毒粒子为球形,外观呈圆形,直径在120 nm左右,特点是体积大,有囊膜,核心电子致密度高,有的在囊膜外可见纤突(图4)。

图4 分离株WHFHV05株电镜观察结果Fig 4 Electron microscope observation results of isolated strain WHFHV05

A:实验组猫;B:空白对照组;C:感染后鼻拭子PCR鉴定M: DNA分子量标准(DL2000);1: FHV-1阳性对照组;2: 阴性对照组;3-5: 实验组猫(1#～3#)A:Experimental group;B:Blank control group;C:PCR identification of nasal swabs of cats after infectionM: DL2000 DNA Maker;1: FHV-1 positive control;2: Negative control; 3-5: Experimental group (1#～3#)图5 感染分离株WHFHV05的猫临床症状观察Fig 5 Observation of clinical symptoms of cats infected with isolate WHFHV05

M: DNA分子量标准(DL2000); 1: FHV-1阳性对照;2-6: 实验组1#猫感染WHFHV05株后3～7 d眼拭子PCR鉴定;7: 阴性对照M: DL2000 DNA Marker; 1: FHV-1 positive control; 2-6: PCR identification of eye swabs 3～7 days after the cats in experimental group 1# were infected with WHFHV05 strain; 7: Negative control图6 感染分离株后猫的临床病料PCR鉴定Fig 6 PCR identification of clinical disease materials of cats infected with the isolates.

2.3 分离株的攻毒实验 F4代细胞培养物病毒含量为108.0TCID50/mL,稀释后进行攻毒实验。图5结果显示,实验组3只猫感染WHFHV05株3 d后均出现眼分泌增加和流鼻涕,随后出现流脓涕及黄色的炎性眼分泌物等临床症状,鼻拭子样品PCR鉴定均为FHV-1阳性;对照组猫未出现明显临床症状。对实验组1#猫感染病毒后3～7 d的眼分泌物进行检测发现FHV-1 gD基因阳性(图6)。同时通过采集实验组和对照组猫血清进行中和试验排除FCV的感染。因此,分离株WHFHV05感染2～3月龄猫临床症状明显,且存在持续排毒的情况。

3 讨论与结论

猫疱疹病毒引起的猫传染性鼻气管炎,对于新生的幼猫或者免疫力低下的猫危害严重,结膜和口鼻黏膜暴露病毒后,FHV-1在这些部位大量的复制,导致发热、打喷嚏、结膜炎、角膜炎和眼鼻分泌物[11-12]。因此,FHV-1的分离和鉴定对于了解猫呼吸道疾病的流行病学和发病机制至关重要。本研究使用F81细胞从临床样本中成功分离FHV-1。在受感染细胞中观察到的细胞病变与之前FHV-1感染的报道一致。受感染的细胞融合聚集,形成大的多核巨细胞,进而形成合胞体是 FHV-1感染的标志[13]。此外,受感染细胞变圆和脱离也是FHV-1感染的典型特征。这些变化表明FHV-1对呼吸道上皮细胞造成了损害,这可能导致受感染的猫出现严重的呼吸道症状。对细胞培养物富集后电镜观察可见明显的外观呈圆形,直径在120 nm左右,有囊膜的病毒颗粒,形状和大小与所报道的猫疱疹病毒颗粒一致[14]。对分离株的糖蛋白gD基因测序分析发现,与GenBank上已报道的猫疱疹病毒Ⅰ型gD基因序列具有100%的同源性,进一步表明分离的毒株为FHV-1。

FHV-1是一种DNA病毒,属于α-疱疹病毒亚科水痘病毒属。该病毒仅存在一种血清型,并且与其他α-疱疹病毒一样,会在三叉神经节中诱导潜伏期。因此,临床上治疗后的猫仍会终生携带病毒,特别是当自身受到应激时,会经历周期性的病毒重新激活,引起二次感染[13]。临床上常见的治疗猫感染FHV-1的药物有泛昔洛韦或阿昔洛韦,这些药物在一定程度上可以改善临床症状,但常存在严重的副作用及治疗后复发的情况[15-17]。目前针对该病的预防主要依赖进口的猫三联疫苗,国内的疫苗产品还处在研发阶段。本研究获得FHV-1分离株WHFHV05以107.0TCID50/mL剂量感染2～3月龄健康猫后,出现脓性的眼鼻分泌物和打喷嚏等临床症状,使用PCR方法对感染猫的眼分泌物进行病原监测发现,病猫在3～7 d内会持续排毒。与报道的FHV-1引起的猫呼吸道感染症状一致[18],说明该分离毒株可用于疫苗研发过程中的检验用毒。

本研究使用细胞培养和分子生物学技术从临床样本中成功分离和鉴定了FHV-1,提供了有关FHV-1流行病学和病原学信息。与此同时,临床感染模型的成功建立为猫疱疹病毒发病机制的研究和疫苗的研发奠定了基础。