血清长链非编码RNA肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1水平与钙化性主动脉瓣狭窄病人左心室功能的相关性研究

许国磊，吴宝，吴欣芳，王吉元，姜北，侯玮琼

作者单位：中国中医科学院广安门医院南区内一科，北京 102600

钙化性主动脉瓣狭窄（CAS）是继冠状动脉疾病和高血压之后心血管疾病的第三大原因。CAS特征为瓣叶缓慢进行性纤维钙化重塑，导致血流阻塞［1］。CAS发病率与年龄相关，由于老龄化现状，CAS发病率将增加，导致全球CAS 疾病负担加重［2］。CAS 需要及时有效诊断和治疗，若治疗不及时将导致心脏肥大，并将进展为心力衰竭。临床上治疗重度狭窄者依赖于主动脉瓣置换术，但该方式需要永久使用抗凝剂，且人工瓣膜使用寿命有限仍面临再次手术问题，且由于病人多为高龄，并多有合并症，导致晚期CAS预后仍较差［3］。因此，准确评价左心室射血分数（LVEF）保留的CAS病人心脏病变情况，对左心室功能评价、制定治疗策略以及评估预后有重要意义。目前，已有研究证实长链非编码RNA（lncRNA）中的长链非编码RNA 肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）、lncRNA HOX 转录反义（HOTAIR）与CAS 进展中的主动脉瓣钙化相关［4］。lncRNA 肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1（AFAP1-AS1）是一种反义lncRNA，位于人4 号染色体，有6 810 个核苷酸，并已证实在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用［5］。近期研究显示，lncRNA AFAP1-AS1 在钙化的主动脉瓣中和人瓣膜间质细胞（VIC）的成骨诱导后表达水平增加；lncRNA AFAP1-AS1 的过表达或敲除可分别促进或抑制VIC 的成骨分化［6］。从机制上讲，lncRNA AFAP1-AS1 通过海绵化微RNA（miR）-155上调SMAD 家族成员5（SMAD5）表达，最终导致VIC的成骨分化［7］。此外，VIC 的成骨分化与主动脉瓣钙化密切相关［8］。但目前针对lncRNA AFAP1-AS1与CAS 病人左心室收缩及舒张功能研究尚不清楚。因此本研究分析了lncRNA AFAP1-AS1 与CAS 病人临床参数以及左心室收缩及舒张功能指标相关性，以期为CAS 病人临床诊断以及左心室损伤功能机制分析提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2020 年1 月至2021 年12 月因CAS 就诊于中国中医科学院广安门医院的129 例病人作为CAS 组（LVEF≥50%），其中男、女分别为73、56 例，年龄（65.16±6.82）岁，身体质量指数（BMI）（22.59±2.30）kg/m2。同期该院健康志愿者130 例作为对照组，排除心脏疾病，均为窦性心律，其中男、女分别为65、65 例，年龄（64.49±6.25）岁，BMI（22.16±2.08）kg/m2。本研究经中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准（批号2019-01-76）。

根据2014 年美国心脏病学会（ACC）/美国心脏协会（AHA）中［9］建议，结合主动脉瓣口面积（AVA）、主动脉瓣峰值流速（Vmax）、主动脉瓣平均压差（PGmean）将CAS 病人分为：轻度狭窄病人（42 例）：AVA＞1.5 cm2、Vmax 2.6～2.9 m/s、PGmean＜20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），中度狭窄病人（48 例）：AVA 1.0～1.5 cm2、Vmax 3.0～4.0 m/s、PGmean 20～40 mmHg，重度狭窄病人（39例）：AVA＜1.0 cm2、Vmax≥4.0 m/s、PGmean≥4.0 mmHg。

纳入标准：（1）经常规超声心动图证实主动脉瓣狭窄（AS）程度为轻度及以上；（2）入组者均签署知情同意书；（3）LVEF≥50%；（4）窦性心律；（5）甲状腺功能正常。排除标准：（1）冠心病、感染性心内膜炎、肺源性心脏病、急性心肌梗死、主动脉瘤、心律失常、糖尿病、主动脉夹层、马方综合征、风湿性AS、痛风、高脂血症等；（2）肾功能不全；（3）经胸超声心动图声窗不佳；（4）瓣膜置换史；（5）合并恶性肿瘤；（6）急性或慢性炎症性疾病。

1.2 方法

1.2.1 血清lncRNA AFAP1-AS1 表达水平检测CAS组在入院后次日（对照组在体检当天）采集空腹外周血，离心取上层血清，利用爱必信公司的RNA提取试剂盒（货号abs60276）得到总RNA，然后在超微量分光光度计（型号nanodropone/one c，赛默飞公司）上检测RNA质量与浓度，并取RNA质检参数在1.8～2.0的样品，按照First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover 试剂盒（货号abs601510）得到互补DNA（cDNA）；然后按照定量预混液（货号abs601511）配制反应体系，在BIO-Rad 定量仪（型号CFX96 Touch）上采集信号。反应程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s 循环40 次。以2-ΔΔCt法计算lncRNA AFAP1-AS1相对表达量，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR检测血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平引物序列

1.2.2 一般资料收集记录入院时病人年龄、性别、体表面积（BSA）、心率、BMI、现病史、舒张压、吸烟史、饮酒史、收缩压等；收集实验室生化检验指标：超敏C 反应蛋白（hs-CRP）、脂蛋白（a）［Lp（a）］、低密度脂蛋白（LDL）、氨基末端B 型利钠肽原（NT-proBNP）、白细胞计数、总胆固醇（TC）、肌酐。

1.2.3 常规超声心动图检查彩色多普勒超声诊断仪Aloka Prosound F75，进行超声心动图检查，探头为UST-52105，频率1.5～5.0 MHz，按照美国超声心动图协会指南标准测量［10］，包括LVEF、Vmax、左室舒张末期内径（LVEDD）、左房前后径（LAD）、二尖瓣口舒张早期及晚期血流速度峰值（E、A 峰）、左室收缩末期内径（LVESD）、室间隔厚度（IVST）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室后壁厚度（LVPWT）。连续多普勒测量PGmean、Vmax。连续性方程法测量主动脉瓣口面积AVA［11］。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0 进行统计。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用LSD 法对两组间差异做进一步分析；两组间比较采用两独立样本t检验；Pearson 法分析lncRNA AFAP1-AS1 与LVEF、LVPWT 等左心室功能指标的相关性。采用受试者操作特征曲线（ROC 曲线）分析血清lncRNA AFAP1-AS1 诊断CAS的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAS 组与对照组一般资料及血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平比较CAS组与对照组年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、BSA、舒张压、心率、TC、LDL 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。CAS 组收缩压、hs-CRP、白细胞计数、NT-proBNP、肌酐、Lp（a）及lncRNA AFAP1-AS1 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 健康志愿者130例与钙化性主动脉瓣狭窄（CAS）129例一般资料及血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平比较

2.2 血清lncRNA AFAP1-AS1 表达与CAS 组病人临床参数关系结果显示，lncRNA AFAP1-AS1 表达与性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史无关（P＞0.05），而与狭窄严重程度有关，其中轻度狭窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表达水平低于中、重度狭窄者，而中度狭窄者lncRNA AFAP1-AS1 表达水平低于重度狭窄者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表达与CAS组病人临床参数关系/

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表达与CAS组病人临床参数关系/

注：lncRNA AFAP1-AS1为长链非编码RNA肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1，CAS为钙化性主动脉瓣狭窄，BMI为身体质量指数。

?

2.3 血清lncRNA AFAP1-AS1 诊断CAS 的ROC曲线ROC 结果显示，血清lncRNA AFAP1-AS1 诊断CAS 的曲线下面积（AUC）为0.86［95%CI：（0.82，0.91）］，灵敏度为79.10%，特异度为81.50%，最大约登指数为0.606，截断值为1.26。血清lncRNA AFAP1-AS1 诊断重度狭窄的AUC 为0.88［95%CI：（0.82，0.94）］，灵敏度为89.70%，特异度为70.00%，最大约登指数为0.597，截断值为1.54。

2.4 CAS 组与对照组超声资料比较CAS 组LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD、PGmean、Vmax水平高于对照组（P＜0.05），AVA水平低于对照组（P＜0.05）；两组间LVEF、LVESD、E 峰、A 峰水平相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 健康志愿者130例与钙化性主动脉瓣狭窄（CAS）129例常规超声心动图参数比较/

表4 健康志愿者130例与钙化性主动脉瓣狭窄（CAS）129例常规超声心动图参数比较/

注：LVEF 为左心室射血分数，LVEDD 为左室舒张末期内径，LVESD 为左室收缩末期内径，LVEDV 为左室舒张末期容积，IVST 为室间隔厚度，LVPWT 为左室后壁厚度，LAD 为左房前后径，E峰为二尖瓣口舒张早期血流速度峰值，A 峰为二尖瓣口舒张晚期血流速度峰值，PGmean 为主动脉瓣平均压差，AVA 为主动脉瓣口面积，Vmax为主动脉瓣峰值流速。

?

2.5 血清lncRNA AFAP1-AS1 表达与超声指标的相关性分析相关性分析显示，血清lncRNA AFAP1-AS1 与LVEDD、LVEDV、LVESD、E 峰、A 峰、PGmean、Vmax 呈正相关，与LVEF、AVA 呈负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 钙化性主动脉瓣狭窄129例血清lncRNA AFAP1-AS1表达与超声指标的相关性分析

3 讨论

CAS 是一种与年龄增长相关的进行性疾病，其特点是细胞外基质（ECM）重塑导致主动脉瓣叶初始增厚，并在进展阶段有钙化沉积［12-13］。CAS 病情较轻时无明显症状，病人难以察觉，随病变进展，将影响瓣膜口的启闭，导致AS，同时病人还会伴有晕厥、呼吸困难等临床症状［14］。目前，CAS尚无有效治疗药物，临床上依赖于瓣膜置换术，然而经导管主动脉置换术及外科主动脉瓣置换术均伴随较高的不良事件风险［3，15］。研究显示，VIC 是主动脉瓣膜中最丰富的细胞类型，它会积极促进钙化形成［16-17］。研究证实，部分lncRNA 家族成员与主动脉瓣钙化过程中的成骨细胞分化相关［4，18］。因此，需要探索CAS 的左心室功能异常相关分子机制，对于寻找早期病情诊断血清标志物以及药物研发有重要意义。

lncRNA AFAP1-AS1 是lncRNA 中重要一员，属于促癌因子，已证实能够促进肿瘤细胞侵袭、迁移等恶性活动［19］。近期研究证实，lncRNA AFAP1-AS1与主动脉瓣钙化有关。过表达lncRNA AFAP1-AS1会促进脂多糖和干扰素处理的THP-1 细胞中M1 极化，但抑制M2 极化，并增强VIC 成骨分化；而沉默lncRNA AFAP1-AS1 则导致M2 极化增加，并抑制VIC 成骨分化［6］。这说明lncRNA AFAP1-AS1 可以促进M1 巨噬细胞极化，从而加剧VIC 成骨分化，在主动脉瓣钙化中发挥作用。本研究结果显示，与对照组相比，CAS 组lncRNA AFAP1-AS1 表达水平明显升高，提示lncRNA AFAP1-AS1 表达水平上调可能与CAS病理过程中的VIC成骨分化异常相关。另有研究显示，退行性钙化性主动脉瓣疾病病人钙化主动脉瓣和人VIC 成骨诱导后lncRNA AFAP1-AS1表达水平均增加，lncRNA AFAP1-AS1 通过海绵miR-155，间接诱导SMAD5 水平增加，促进VIC 成骨分化［7］。推测lncRNA AFAP1-AS1 通过调节巨噬细胞，或靶向miRNA/mRNA 表达，诱导VIC 成骨分化，导致主动脉瓣钙化，进而推动CAS。

本研究结果显示，血清lncRNA AFAP1-AS1 表达水平与性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史无关，而与狭窄严重程度有关，其中轻度狭窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表达水平显著低于中、重度狭窄者，中度又低于重度狭窄者，说明血清lncRNA AFAP1-AS1 与CAS 狭窄程度密切相关，其持续异常高表达将大量诱导VIC成骨分化，推动钙化形成，促进病情进展。因而这提示可以通过检测CAS 病人血清lncRNA AFAP1-AS1 水平变化为CAS 诊断和病情严重程度评估提供依据。ROC 结果显示，血清lncRNA AFAP1-AS1 诊断CAS 的AUC 为0.86，灵敏度为79.10%，特异度为81.50%；其诊断重度狭窄的AUC为0.88，灵敏度为89.70%，特异度为70.00%，提示可以将血清lncRNA AFAP1-AS1 作为临床诊断CAS 及区分病人病情的辅助指标，以便于尽早制定治疗策略，但后续应纳入更大样本量进一步验证。

超声资料比较结果发现，CAS 组与对照组LVEF、LVESD、E峰、A峰水平比较差异无显著性，而CAS 组LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD 水平较高，这与张计青等［20］研究一致，说明CAS 病人心肌舒张、收缩功能均损伤。经Pearson 相关性分析，血清lncRNA AFAP1-AS1与LVEF呈负相关，与LVESD呈正相关，说明其可以反映CAS 病人左心室收缩功能；血清lncRNA AFAP1-AS1 与LVEDD、LVEDV、E峰、A 峰呈正相关，说明lncRNA AFAP1-AS1 与CAS病人的左心室舒张功能有关；血清lncRNA AFAP1-AS1与PGmean、Vmax、AVA 存在明显相关性，再次证实血清lncRNA AFAP1-AS1 能够用来评估CAS 严重程度。以上结果说明CAS病人血清lncRNA AFAP1-AS1水平变化与超声心动图相关参数具有一定相关性，说明lncRNA AFAP1-AS1与左心室功能及CAS病情严重程度密切相关，但尚不能证实lncRNA AFAP1-AS1与以上指标具有因果关系，同时仍未明确lncRNA AFAP1-AS1在CAS左心室功能变化中的具体机制，接下来我们将通过细胞实验等探究lncRNA AFAP1-AS1参与左心室功能调节的具体机制，以期为临床治疗提供依据。

综上所述，CAS 血清lncRNA AFAP1-AS1 表达水平升高，与狭窄严重程度有关，且其异常程度与左心室舒张、收缩功能有关，血清lncRNA AFAP1-AS1可能成为诊断CAS 及病情严重程度的潜在生物标志物，但具体作用机制仍有待研究。