肠道微生态对子痫前期发病的影响

王晓艳, 李莲英, 王燕侠, 张翰儒, 刘婷婷

甘肃省妇幼保健院妇产科(甘肃兰州 730050)

子痫前期(pre-eclampsia, PE)是常见的妊娠并发症,患者可出现血压升高及蛋白尿临床症状,发病机制复杂,可导致全球2%～8%的妊娠复杂化[1]。PE患者可增加肾衰竭、急性肺水肿、胎儿窘迫及死产的发生风险,严重影响母婴生命安全[2]。PE的诱发因素存在多种,包含氧化应激、脂质代谢异常、内皮细胞损伤等,但是具体机制还不清楚。肠道微生态系统由正常的肠道菌群及其生存环境组成。肠道菌群是肠道微生态系统的核心部分,占据人体微生物78%,肠道菌群稳定性对机体健康至关重要,当其稳定性被破坏后可诱发多种肠道及其他疾病[3]。以往研究证实肠道菌群对机体新陈代谢、营养吸收等产生影响,当肠道菌群失衡可诱导全身炎症反应,增加2型糖尿病、动脉硬化、慢性肾病及PE的发生概率[4]。PE的发生、发展与肠道菌群失衡存在关联,认为肠道菌群紊乱后调节机体免疫细胞,加快炎症反应而降低抑炎因子的表达,当致炎因子增加和抑炎因子表达失衡后,加快血管内皮细胞收缩,血管内皮细胞功能紊乱认为是导致血压升高的的病理生理机制[5]。肠道微生物与人体形成一个超级有机体,微生物的改变会对孕妇的健康产生影响,因此了解肠道微生态与PE之间的关系,对于患病风险预测和精准干预非常重要。本研究探讨肠道微生态与PE的关系,为相关研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年1月至2022年6月我院收治的40例PE患者作为研究对象。诊断标准:符合谢幸等主编的第8版《妇产科学》教材中PE的标准[6]。纳入标准:(1)汉族;(2)年龄18～34岁;(3)单胎妊娠;(4)自然受孕;(5)无感染及近期用药史;(6)具有良好的依从性。排除标准:(1)近2周内服用益生菌、抗生素、激素等影响肠道菌群的药物。(2)患有恶性肿瘤;(3)有胎膜早破、阴道流血、腹痛等临产征象者。40例PE患者中孕26周20例,孕36周为20例,同一时期收取40例健康孕妇,其中26周20例,孕36周为20例,所有研究对象均知晓本研究内容,并签署知情同意书。已经我院伦理委员会审核批准(2021-0010)。

1.2 方法

1.2.1 分组及一般资料 40例PE患者按照孕周不同分为两组,26周PE孕妇作为A1组(n=20),36周PE孕妇作为A2组(n=20);40例健康孕妇按照孕周不同分为两组,26周健康孕妇作为B1组,36周健康孕妇作为B2组(n=20)。各组研究对象一般资料见表1。

表1 各组研究对象一般资料比较

1.2.2 粪便标本 各组研究对象在入院后首日及健康体检时,采用粪便标本5 g。方法:排净尿液,将无菌垫单铺在便池内,粪便排在其上,洗净双手后采用样勺挖取未接触空气及垫单等粪便约5 g,-80℃保存。

1.2.3 DNA提取及16S rDNA的扩增及测序 (1)DNA提取:采用Omega Stoo1DNAKit试剂盒(广州飞扬生物工程有限公司)提取粪便标本基因组DNA,具体方法严格按照试剂盒说明书进行。(2)16S rDNA的扩增及测序:将稀释(1∶25)后的基因组DNA为模板,采用含有Barcode的细菌的16S rDNA基因V3-V4的特异性引物。对粪便中细菌的DNA进行扩增。反应条件:①94℃预变性5 min;②94℃变性30 s,56°退火30 s,72℃延伸20 s,40个循环;③循环结束后,72℃延申5 min。对PCR产物进行电泳分析,磁珠纯化后进行定量分析。根据PCR产物浓度进行定量分析,并上机测序。

1.2.4 生物信息学分析 (1)采用Illumina-Misq高通量测序平台进行测序,得到结果以Fq文件进行存储。(2)采用Trimmomatic软件去杂,后进行拼接,得到完整序列。对序列进行处理最终得到有效标签。(3)采用Vsearch软件将有效标签,按照≥97%的相似度进行分类,得到可操作分类单元,将其中丰度最大的序列作为该单元的代表序列。(4)按照界、门、纲、目、科、属逐级将肠道菌群进行结构分层,得到可操作单元注释结果后按照分类进行汇总,得到各个样本的相对丰度,基于16S rRNA扩增子测序结果预测生物群落功能,与《京都基因及基因组百科全书》对比差异。

2 结果

2.1 B1组及B2组肠道菌群α多样性及肠道菌群差异的比较 B1组及B2组肠道菌群α多样性比较,B2组Chao1及Observed-Species指数均低于B1组(P<0.001),见表2、图1。B1组及B2组肠道菌群差异比较:与B1组相比,B2组艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium)、马氏羊蹄菌(Fournierella)、普雷沃菌(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)的丰度升高,双歧杆菌(Bifidobacterium)及普拉梭菌(Faecalibacterium)的丰度降低,见图2。

图1 B1组及B2组肠道菌群α多样性

图2 B1组及B2组肠道菌群差异比较

表2 B1组及B2组肠道菌群α多样性比较

2.2 A1组及B1组肠道菌群α多样性及肠道菌群差异的比较 A1组及B1组肠道菌群α多样性比较,A1组Chao1及Observed-Species指数均低于B1组(P<0.001),见表3、图3。A1组及B1组肠道菌群差异比较:与B1组相比,A1组Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium丰度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的丰度降低(P<0.05),见图4。

图3 A1组及B1组肠道菌群α多样性比较

图4 A1组及B1组肠道菌群差异比较

表3 A1组及B1组肠道菌群α多样性比较

2.3 A2组及B2组α多样性及肠道菌群差异的比较 A2组及B2组肠道菌群α多样性比较;A2组Chao1及Observed-Species指数均低于B2组(P<0.001),见表4、图5。A2组及B2组肠道菌群差异比较:与B2组相比,A2组Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium丰度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的丰度降低,见图6。

图5 A2组及B2组α多样性比较

图6 A2组及B2组肠道菌群差异比较

表4 A1组及B1组肠道菌群α多样性比较

2.4 A1组及A2组α多样性及肠道菌群差异的比较 A1组及A2组肠道菌群α多样性比较:A2组Chao1及Observed-Species指数均低于A1组(P<0.001),见表5、图7。A1组及A2组肠道菌群差异的比较:与A1组相比,A2组Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium丰度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的丰度降低,见图8。

图7 A1组及A2组α多样性比较

图8 A1组及A2组肠道菌群差异的比较

表5 A1组及A2组α多样性比较

3 讨论

PE是妊娠期常见的疾病之一,妊娠20周后患者出现血压升高及蛋白尿,患者可产生头痛、胃肠道反应等症状,并随着疾病的发展,可出现抽搐及昏迷等症状,增加母婴不良反应甚至导致妊娠终止。现阶段,有研究认为PE与肠道微生态息息相关,而肠道菌群是肠道微生态主要组成部分,可通过调节免疫系统发育及营养物质的的正常代谢,但是当其稳定性失调后可诱导免疫系统或其他系统疾病,而影响母婴安全[7]。本研究通过分析PE与肠道菌群的关系,认为随着PE患者孕周的延长而肠道菌群致病性增加。

本研究结果显示,与B1组相比,B2组肠道菌群α多样性降低,且Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium等致病菌丰度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium等有益菌丰度降低,说明女性肠道菌群成分及肠道菌群的占比也会发生改变,随着孕周的延长而肠道菌群致病性增加。在妊娠过程中随着孕期的增加,生理肠道菌群发生改变,细胞多样性降低,致病菌丰度升高[8]。本研究与之相似。但孕早期这种现象不明显,孕晚期较明显。在妊娠期间,肠道菌群会随着进程的增加而改变,妊娠中晚期菌群多样性降低,且Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium丰度增加,Bifidobacterium及Faecalibacterium菌群丰度降低。原因与妊娠期间发生免疫系统改变,而肠道菌群又影响着免疫细胞活化状态,导致上述致病菌增加,加快肠道疾病的产生[9]。

本研究结果显示:与B1/B2组相比,A1/A2组肠道菌群α多样性降低,致病菌丰度增加,有益菌丰度降低,并随着孕周时间的延长而变化显著,说明PE疾病与肠道菌群感染存在关联,并与孕期时间相关。PE患者的肠道菌群因短链脂肪酸分泌降低,故产生有益菌的能力降低,导致肠道菌群动态平衡被打破,致病菌增加[10]。Clostridium属于革兰阳性厌氧菌,能够分泌毒素而参与动脉血管痉挛,同时释放升压物质而导致血压升高[11]。Prevotella属于革兰阴性厌氧菌,可表达一些与氧化应激相关的还原酶类物质,并可调节炎症物质而加快免疫性疾病或机体的感染率[12]。Fusobacterium是梭菌门最主要的菌属,革兰阴性厌氧菌,可在人类和动物的身体共生,可聚集在结肠,会引起菌血症和各种快速进展的感染。同时,Fusobacterium毒性更强,能够产生重要的脂多糖(LPS)、内毒素和溶血素等,增加机体毒力[13-14]。Bifidobacterium为革兰阳性厌氧杆菌,具有合成维生素、与其他厌氧菌在黏膜表面形成生物屏障、防止外袭菌、刺激免疫功能、激活巨噬细胞、提高宿主抗感染能力及抗肿瘤等功能[15]。Faecalibacterium在健康人体中表达较高,可减少脂肪组织及肠道组织中炎症表达,同时具有维持肠道完整性及改善炎症损伤的作用[16]。有研究表明,在PE组的肠道菌群中,致病菌之间的正相关更为显著,例如Fusobacterium及Clostridium丰度升高,有益菌丰度降低,表示患者肠道菌群共生关系发生紊乱,加重肠道功能障碍,并认为与PE的发生关系密切[17-18]。与健康孕妇相比,PE患者肠道有益菌降低,本研究表明,与26/36周健康孕妇的肠道菌群相比,与26/36周的PE患者中肠道菌群存在差异,主要表现为致病菌丰度增加而有益菌丰度降低。原因是血压升高时去甲肾上腺及交感神经活性增强,导致肠道通透性升高,肠道炎症反应加重,进一步紊乱肠道菌群,致病菌活性增强并可随着病程时间的延长而加剧。

本研究结果显示:与A1组相比,A2组孕妇肠道菌群多样性降低,且上述致病菌升高而有益菌丰度降低,认为PE孕妇本身肠道菌群紊乱性较高,并随着孕周的延长而紊乱性更强。有研究表明,随着孕期的延长母体肠道菌群会发生改变,达到孕晚期时肠道菌群多样性显著降低,原因与机体代谢功能、内分泌系统等相关[19]。另外,有研究表明,妊娠过程中肠道抗炎作用的菌群丰度降低,致病菌丰度升高,在孕早期变化不明显,孕晚期表现最显著[20]。本研究认为与子痫前期孕26周孕妇相比,36周子痫前期孕妇随着孕周的延长肠道菌群多样性降低,致病性增高,针对这种情况,临床医生应重点对孕晚期孕妇的肠道菌群进行排查,有利于降低对胎儿发育的不良影响。

综上所述,健康孕妇会随着孕周的延长肠道菌群α多样性降低,致病菌Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium丰度增加;PE肠道菌群致病性高于健康孕妇,且α多样性降低;PE会随着孕周的增加,肠道菌群α多样性降低,且上述致病菌丰度增加,有益菌Bifidobacterium及Faecalibacterium占比降低,认为加强PE机体肠道菌群的监测对于预防炎症性疾病具有重要意义。

利益相关声明:本文无利益冲突。

作者贡献说明:王晓艳进行论文的构思与设计、统计学处理,撰写论文,并对论文整体负责、监督管理;李莲英:进行研究的实施与可行性分析、数据整理;王燕侠、张翰儒:进行数据收集;王晓艳、刘婷婷:进行结果的分析与解释、论文的修订,负责论文的质量控制及审校。