miR-9、miR-194在鼻咽癌组织中的表达及与其预后的关系

陈璀璀 李永磊 芦二永

鼻咽癌为头颈部恶性肿瘤,好发于我国南方地区,与其他头颈部恶性肿瘤相比,鼻咽癌在临床表现、病因、肿瘤治疗等方面均存在显著差异,且易发生早期转移,疾病预后较差[1-3]。相关研究显示,鼻咽癌确诊病例中60%以上已发生淋巴结转移或远处转移[4]。通过对鼻咽癌患者预后效果进行评估,实施针对性分流及疗效监测,有助于提升治疗效果,节约医疗资源。微RNAs(MicroRNAs)分子属于非编码小RNA,其中的miR-9分子可参与糖尿病、胚胎神经发育及胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生与转移[5-6]。miR-194基因序列位于染色体上脆弱位点---1q41上,这同人类基因组中大多数miRNA编码基因相同,位于同癌症相关的不稳定脆性位点[7]。但miR-9、miR-194在鼻咽癌患者中相关研究比较少。基于此,本研究尝试探究miR-9、miR-194在鼻咽癌患者中的表达水平,以及对预后的预测价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2020年10月至2022年10月我院鼻咽癌患者76例,随访3～36个月,根据预后情况分为死亡组(n=21例),存活组(n=55例)。纳入标准:经病理组织学检查确诊者;首次确诊为鼻咽癌;临床资料完整详细。排除标准:入院前曾接受抗肿瘤治疗;合并其他恶病质;合并严重感染;精神障碍性疾病;处于妊娠或哺乳期;免疫功能异常;无其他伴发疾病。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 采用Excel表格,详细统计患者年龄、性别、体质量指数(BMI)、病灶部位、临床分期、肿瘤分期、组织分化程度、淋巴结转移及远处转移情况等。

1.2.2 miR-9、miR-194检测方法 患者入院后取病理学组织,检测癌组织中miR-9、miR-194表达,同时采取患者空腹外周静脉血5 ml,留置于含促凝剂采血管中,在4 ℃的环境中静置30 min,采用低温离心机进行分离处理,设置离心转速为3500 r/min,半径为8 cm,时间为15 min,留取上清液,置于-20 ℃环境下保存;测定血清中miR-9、miR-194表达水平,提取总RNA,纯化后采用紫外分光光度计测定RNA浓度、纯度,逆转录cDNA,应用PCR引物上实时定量PCR仪及miRNA茎环引物检测,条件95 ℃预变性0 min、95 ℃变性15 s、60 ℃ 1 min,40个循环。以U6为内参,目的基因相对表达量以2-△△Ct表示。由病理科医师对每张切片取5个400倍视野,以染色强度结合阳性细胞百分比进行综合积分,积分标准:阴性(-)记0分,弱阳性(+)记1～4分,中度阳性(++)记5～8分,强阳性(+++)记9～12分,总分0～4分为低表达,5～12为高表达。

1.2.3 调强放疗方法 所有鼻咽癌患者均接受调强放疗,指导患者取仰卧体位,借助CT模拟机确定扫描中心,以层厚3 mm进行CT扫描,图像重建,明确高危及低危临床靶向体积,两者用药均为2.0 Gy/f,总量维持在55 Gy,28次/6周作为首个疗程,随后根据个体情况适当放缓放疗频率,每3个月复查一次。

1.2.4 随访方法及预后情况 治疗后均持续随访3～36个月,以门诊登记访问或电话随访为主,了解患者预后情况,死亡患者以死亡时间为随访截止时间,无患者失联或中途退出。76例鼻咽癌患者,21例死亡,55例存活。

1.3 观察指标

(1)比较不同临床特征的鼻咽癌患者miR-9、miR-194表达水平。(2)比较不同预后的鼻咽癌患者miR-9、miR-194表达水平。(3)分析鼻咽癌患者预后相关影响因素。

1.4 统计学分析

应用统计学软件SPSS 19.0处理数据,计数资料以例数描述,采用χ2检验,计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验,均确认具备方差齐性且近似服从正态布,以平均数±标准差描述,两组间比较采用独立样本t检验;采用Logistic多因素回归分析鼻咽癌患者预后的影响因素。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征鼻咽癌患者miR-9表达水平比较

76例鼻咽癌患者miR-9高表达29例,低表达47例,miR-9表达水平与鼻咽癌患者年龄、性别、BMI、病灶部位无关(P>0.05);miR-9低表达患者的临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤分期为T3～T4期、组织分化程度为高、中分化、发生淋巴结转移及远处转移的比例高于miR-9高表达患者(P<0.05),见表1。

表1 不同临床特征鼻咽癌患者miR-9表达水平(例,%)

2.2 不同临床特征的鼻咽癌患者miR-194表达水平比较

76例鼻咽癌患者,miR-194高表达35例,低表达41例,miR-194表达水平与鼻咽癌患者年龄、性别、BMI、病灶部位无关(P>0.05);miR-194低表达患者的临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤分期为T3～T4期、组织分化程度为高、中分化、发生淋巴结转移及远处转移的比例高于miR-194高表达患者(P<0.05),见表2。

表2 不同临床特征鼻咽癌患者miR-194表达水平(例,%)

2.3 不同预后的鼻咽癌患者临床资料比较

两组患者年龄、性别、BMI、病灶部位相比无显著差异(P>0.05),两组临床分期、肿瘤分期、组织分化程度、淋巴结转移及远处转移情况、miR-9表达水平、miR-194表达水平比较差异显著(P<0.05),见表3。

表3 不同预后的鼻咽癌患者临床资料比较(例,%)

2.4 鼻咽癌患者预后相关影响因素

经Logistic回归分析结果显示,临床分期、肿瘤分期、组织分化程度、淋巴结转移及远处转移情况、miR-9表达水平、miR-194表达水平为鼻咽癌患者预后影响因素(P<0.05),见表4。

表4 鼻咽癌患者预后Logistic回归分析

3 讨论

鼻咽癌是发源于鼻咽腔侧壁及顶部的恶性肿瘤,中国为鼻咽癌高发国家,且发病率呈逐渐升高趋势,已成为我国重点关注的健康问题[8-10]。既往研究显示,鼻咽癌患者一旦发生病灶转移,其中位生存期往往不超过1年[11]。因此,如何有效预测及进一步改善鼻咽癌疾病预后尤为重要。

近年来,miRNAs生物学作用备受临床关注,有研究认为其可通过调控相应靶基因进而参与细胞中各种生命活动[12-13]。相关文献报道[14]在肿瘤细胞中,多数受miRNAs调控的基因在癌症发生发展中扮演重要角色,故推测miRNAs在肿瘤治疗方面具有一定应用价值。此外,miRNAs在肿瘤样品中表达量发生变化,被证实具有诊断或预后价值。比如,特定浓度的miR-149-5p可促进胃癌细胞增殖与迁移,有望成为胃癌预防新靶标[15]。王皓颖等[16]研究发现,miR-93表达水平对鼻咽癌预后效果评估价值良好。除上述miRNAs成员外,在鼻咽癌患者临床同样发现一些具有较高临床意义的miRNAs标志物,如miR-9、miR-194等,但目前临床对其在鼻咽癌中的作用认识仍较为有限。基于此,本研究对miR-9、miR-194在鼻咽癌中表达情况进行系统调查,以了解miR-9、miR-194与鼻咽癌发生的关系及预后相关性,旨在为临床治疗鼻咽癌及改善预后提供新的研究思路。由本研究数据可知,76例鼻咽癌患者miR-9高表达29例,低表达47例,miR-194高表达35例,低表达41例,说明miR-9、miR-194可能是潜在的鼻咽癌抑癌基因,进一步进行统计学分析验证,发现miR-9、miR-194低表达患者的临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤分期为T3～T4期、组织分化程度为高度/中等分化、发生淋巴结转移及远处转移的比例高于miR-9、miR-194高表达患者,一定程度上说明miR-9、miR-194可能参与鼻咽癌肿瘤发展过程中。有研究认为[17],E-cadherin变化为miR-9调节鼻咽癌肿瘤细胞迁移及侵袭能力的关键蛋白,负向调控鼻咽癌细胞中miR-9表达,可抑制肿瘤细胞侵袭、增殖及迁移。既往研究表明[18],miR-194-5p低表达可激活mTOR信号通路,对细胞增殖及侵袭具有上调作用,miR-194-5p过表达可抑制mTOR信号通路,对细胞增殖及侵袭具有下调作用。上述研究为本研究结果提供佐证。

miRNAs在鼻咽癌相关信号通路调节、蛋白表达调控过程中发挥重要作用,同肿瘤细胞增殖及侵袭转移密切相关,可能是评估鼻咽癌预后的新靶点[19]。本研究随访3～36个月,发现76例鼻咽癌患者,21例死亡,55例存活,比较不同预后的鼻咽癌患者临床资料发现,两组临床分期、肿瘤分期、组织分化程度、淋巴结转移及远处转移情况、miR-9表达水平、miR-194表达水平比较差异显著(P<0.05),说明鼻咽癌患者临床特征及miR-9、miR-194表达水平与预后结果相关。Lu等[20]研究证实,鼻咽癌细胞分泌的miR-9主要以外泌体介导形式进入内皮细胞发挥功能,对血管内皮细胞产生影响,参与鼻咽癌转移等。已有研究报道mTOR通路在头颈部鳞癌的作用机制,有研究认为,miR-194-5p表达下调,可促进磷酸化状态的mTOR表达,上调继续与下游底物结合的能力,进而发挥促癌作用[21]。进行Logistic回归分析发现,临床分期、肿瘤分期、组织分化程度、淋巴结转移及远处转移情况、miR-9表达水平、miR-194表达水平为鼻咽癌患者预后影响因素(P<0.05),进一步证明miR-9、miR-194表达水平与鼻咽癌患者预后息息相关,综合考虑miR-9、miR-194表达,不但能反映鼻咽癌恶性生物学行为进程,还可提高对预后不良结局的预测效果。

综上所述,miR-9、miR-194低表达与鼻咽癌患者恶性生物学行为进程及预后有关,该研究提示miR-9、miR-194可能是鼻咽癌预后评估的有效分子靶点,值得临床进一步深入探究。