香附的化学成分及其体外抗炎活性研究

2024-03-14 03:48韩建卫孙延平杨炳友王秋红匡海学黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室哈尔滨50040广东药科大学中药学院广州50006
中南药学 2024年2期
关键词:淡黄色分子式香附

韩建卫,孙延平,杨炳友,王秋红,匡海学*(.黑龙江中医药大学,教育部北药基础与应用研究重点实验室,哈尔滨 50040;.广东药科大学中药学院,广州 50006)

香附为莎草科莎草属植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎[1]。香附味辛、微苦、微甘,性平,归肝、脾、三焦经,具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效[2]。香附的主要化学成分有萜类、黄酮、生物碱、蒽醌类、甾醇类、糖类[3]。现代药理学研究表明,香附具有抗肿瘤、抗抑郁、抑菌、抗炎和抗氧化等药理作用[4]。为了进一步对香附资源的开发和利用,本课题组首次使用制备型正相高效液相色谱技术对香附石油醚层进行系统分离,从中共分离并鉴定了15个萜类化合物,结构见图1,现报道如下。

图1 化合物1~15 的结构式Fig 1 Structures of compounds 1~15

1 材料

香附购于芍花堂国药股份有限公司,经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋教授鉴定为莎草科莎草属植物莎草CyperusrotundusL.的根茎。原植物标本(编号:20220331)保存于黑龙江中医大学中药化学实验室。

Bruker-600型超导核磁共振仪(德国Bruker公司);Q-TOF(ESI)高分辨质谱仪、2424-2998型分析HPLC仪(美国Waters公司);制备型硅胶色谱柱(19 mm×250 mm,10 μm,苏州速研医药科技有限公司);柱色谱用硅胶80~100目、200~300目(青岛海洋化工有限公司);Silicage160 GF254薄层高效色谱硅胶板(美国默克公司);柱色谱用化学试剂(分析纯,天津富宇精细化工有限公司);正己烷、乙酸乙酯(色谱纯,上海麦克林生化科技股份有限公司);恒温培养箱(美国赛默飞公司);脂多糖(LPS)、地塞米松(美仑生物科技有限公司);BV-2 细胞及专用培养基(普诺赛生命科技有限公司);胰酶细胞消化液、一氧化氮(NO)检测试剂盒(碧云天公司)。

2 方法

2.1 提取分离

称取干燥香附45 kg,粉碎过筛,用95%乙醇加热回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液,减压回收溶剂,得总浸膏(3.3 kg)。总浸膏加适量蒸馏水混悬,依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3次,减压回收溶剂,得石油醚萃取部位(1.2 kg)、乙酸乙酯萃取部位(1.1 kg)和水饱和正丁醇萃取部位(1.0 kg)。取石油醚萃取部位(300 g)经硅胶柱色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯(100∶0~0∶100)梯度洗脱,经TLC分析后合并,得到14个流分Fr.A~Fr.N。

Fr.C经硅胶柱色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯(100∶1~10∶1)梯度洗脱,得Fr.C1~Fr.C17。Fr.C6经制备型正相HPLC(正己烷-乙酸乙酯=80∶1)分离纯化得到化合物1(5.2 mg)。Fr.C8经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,得到5个流分Fr.C8-1~Fr.C8-5,Fr.C8-2经制备型HPLC(正己烷-乙酸乙酯=50∶1)分离纯化得到化合物3(7.0 mg)、8(7.0 mg)、9(7.0 mg)和11(6.9 mg)。Fr.C11经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,得到4个流分Fr.C11-1~Fr.C11-4,Fr.C11-2 经制备型HPLC(正己烷-乙酸乙酯=40∶1)分离纯化得到化合物2(7.0 mg)、4(6.9 mg)和5(7.4 mg)。Fr.C14经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,得到3个流分Fr.C14-1~Fr.C14-3,Fr.C14-2经制备型HPLC(正己烷-乙酸乙酯=30∶1)分离纯化得到化合物7(7.0 mg)。

Fr.E经硅胶柱色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯(50∶1~0∶1)梯度洗脱,得Fr.E1~Fr.E9。Fr.E3经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,得到3个流分Fr.E3-1~Fr.E3-3,Fr.E3-2经制备型HPLC(正己烷-乙酸乙酯=10∶1)分离纯化得到化合物13(7.0 mg)、14(7.0 mg)和15(7.0 mg)。Fr.E5经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,得到5个流分Fr.E5-1~Fr.E.5-5,Fr.E5-2经制备型HPLC(正己烷-乙酸乙酯=8∶1)分离纯化得到化合物10(7.0 mg)、12(7.0 mg)和6(7.0 mg)。

2.2 体外抗炎活性评价

2.2.1 细胞的培养及毒性评价 采用CCK-8法测验化合物对BV-2细胞毒性的作用。BV-2小胶质细胞在37℃、5% CO2的培养箱中培养。将BV-2细胞以1×105个·mL-1接种于96孔板中,每孔100 μL。待细胞贴壁后,分为空白组及不同浓度给药组(6.25、12.5、25、50、100 μmol·mL-1),每组6个复孔,培养24 h。每孔加入10 μLCCK-8溶液,在37℃下培养3 h后,在450 nm处测定吸光度(A)值。

2.2.2 NO含量的测定 将BV-2细胞以 1×105个·mL-1接种于96孔板中,每孔100 μL。待细胞贴壁后,加入含药培养基。实验组分别设置为空白组、模型组、阳性药组、给药组,每组6个复孔。空白组和模型组加入不含药培养基,孵育细胞1 h后,除空白组外,其他各组均加入LPS(0.5 μg·mL-1),继续孵育细胞24 h,收集细胞上清液,按照试剂盒说明书检测NO的含量。

2.2.3 统计学分析 应用软件GraphPad Prism 8.0对数据进行处理和统计学说明,通过对NO抑制率的大小表示化合物体外抗炎活性的强弱,结果以±s的形式表示。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1:淡黄色油状,分子式为C31H50O。HR-ESI-MSm/z:437.3864 [M-H]-(计算值437.3862),[α]25D=+22.2°(c0.33,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.86(1H,m,H-1a),1.54(1H,m,H-1b),2.71(1H,m,H-2a),2.31(1H,m,H-2b),1.72(1H,m,H-5),1.55(2H,m,H-6),1.92(1H,m,H-7a),1.31(1H,m,H-7b),1.59(1H,m,H-8),1.40(1H,m,H-11a),1.10(1H,m,H-11b),1.32(2H,m,H-12),1.67(2H,m,H-15),2.05(1H,m,H-16a),1.14(1H,m,H-16b),1.64(1H,m,H-17),1.00(3H,s,H-18),0.79(1H,m,H-19a),0.58(1H,m,H-19b),1.41(1H,m,H-20),0.90(3H,d,J=5.6 Hz,H-21),1.13(2H,m,H-22),2.13(1H,m,H-23a),1.89(1H,m,H-23b),2.24(1H,m,H-25),1.03(3H,m,H-26),1.03(3H,m,H-27),0.91(3H,s,H-28),1.05(3H,s,H-29),1.10(3H,s,H-30),4.72(1H,br.s,H-31a),4.67(1H,br.s,H-31b);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:33.4(C-1),37.4(C-2),216.5(C-3),50.2(C-4),48.4(C-5),21.5(C-6),28.1(C-7),47.9(C-8),21.1(C-9),27.0(C-10),25.9(C-11),35.6(C-12),45.4(C-13),48.8(C-14),32.8(C-15),26.8(C-16),52.3(C-17),18.3(C-18),29.5(C-19),36.1(C-20),18.1(C-21),35.0(C-22),31.3(C-23),156.9(C-24),33.8(C-25),22.0(C-26),21.9(C-27),19.3(C-28),22.2(C-29),20.8(C-30),106.0(C-31)。以上数据与文献[5]报道基本一致,故鉴定化合物1为24-methylenecycloartenone。

化合物2:淡黄色固体,分子式为C15H22O。HR-ESI-MSm/z:217.1673 [M-H]-(计算值217.1671),[α]25D=-28.4°(c0.84,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:0.83(3H,s,H-12),1.01(3H,s,H-13),0.85(3H,d,J=6.0 Hz,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:68.7(C-1),25.6(C-2),33.9(C-3),134.5(C-4),176.6(C-5),28.3(C-6),48.2(C-7),27.1(C-8),27.9(C-9),36.1(C-10),41.6(C-11),26.2(C-12),19.3(C-13),188.2(C-14),18.0(C-15)。以上数据与文献[6]报道基本一致,故鉴定化合物2为cyperenal。

化合物3:白色固体,分子式为C15H22O。HR-ESI-MSm/z:217.1675 [M-H]-(计算值217.1671),[α]25D=-115.2°(c0.56,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.65(1H,ddd,J=13.5,9.5,1.4 Hz,H-2a),1.89(1H,m,H-2b),2.44(1H,br.dd,J=18.2,9.5 Hz,H-3a),2.78(1H,br.dt,J=18.0,9.5 Hz,H-3b),2.05(1H,t,J=3.5 Hz,H-7),1.73(1H,m,H-8a),1.93(1H,ddt,J=6.5,3.5,14.0 Hz,H-8b),1.15(1H,ddt,J=12.0,7.1,14.0 Hz,H-9a),1.57(1H,dt,J=14.0,6.5 Hz,H-9b),2.16(1H,ddq,J=12.0,6.5,6.5 Hz,H-10),1.01(3H,s,H-12),0.88(3H,s,H-13),2.07(3H,q like,H-14),1.01(3H,d,J=6.5 Hz,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:63.7(C-1),26.2(C-2),43.5(C-3),148.5(C-4),139.6(C-5),207.3(C-6),63.0(C-7),25.9(C-8),28.1(C-9),34.6(C-10),41.4(C-11),19.0(C-12),26.4(C-13),15.2(C-14),17.9(C-15)。以上数据与文献[7]报道基本一致,故鉴定化合物3为patchoulenone。

化合物4:白色固体,分子式为C15H24O。HR-ESI-MSm/z:219.1825 [M-H]-(计算值219.1827),[α]25D=-22.4°(c0.83,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:2.03(1H,dd,J=9.8,6.8 Hz,H-1),2.13(2H,m,H-2),5.18(1H,m,H-3),1.45(1H,m,H-7a),1.16(1H,m,H-7b),1.68(1H,m,H-8a),1.43(1H,m,H-8b),1.57(1H,m,H-9),2.23(1H,d,J=11.2 Hz,H-11a),1.41(1H,m,H-11b),1.75(3H,m,H-12),1.10(3H,s,H-13),1.08(3H,s,H-14),0.98(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:55.1(C-1),31.1(C-2),124.6(C-3),143.4(C-4),69.7(C-5),74.7(C-6),37.1(C-7),25.7(C-8),49.4(C-9),42.3(C-10),37.8(C-11),16.4(C-12),25.7(C-13),26.2(C-14),27.6(C-15)。以上数据与文献[8]报道基本一致,故鉴定化合物4为4,5,6,7,8,8a-六氢-3,4,8,8-四甲基-1H-3a,7-亚甲基甘菊环-4-醇甲酸酯。

化合物5:淡黄色固体,分子式为C15H24O。HR-ESI-MSm/z:219.1829 [M-H]-(计算值219.1827),[α]25D=+28.2°(c0.61,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.40(1H,ddd,J=12.8,7.9,0.75 Hz,H-2a),1.79~1.75(1H,m,H-2b),2.62(1H,m,H-3a),2.24(1H,dd,J=16.2,9.4 Hz,H-3b),4.28(1H,s,H-6),1.63(1H,t,J=3.4 Hz,H-7),1.36~1.30(2H,m,H-8a,H-9b),1.73~1.68(1H,m,H-8b),0.84~0.77(1H,m,H-9a),1.84~1.79(1H,m,H-10),1.08(3H,s,H-12),0.87(3H,s,H-13),0.81(3H,d,J=6.4 Hz,H-14),1.81(3H,m,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:67.5(C-1),26.4(C-2),42.8(C-3),132.3(C-4),145.8(C-5),73.0(C-6),58.3(C-7),26.4(C-8),28.7(C-9),34.9(C-10),40.5(C-11),27.4(C-12),20.2(C-13),17.8(C-14),14.6(C-15)。以上数据与文献[9]报道基本一致,故鉴定化合物5为4-烯-广藿香醇。

化合物6:淡黄色晶体,分子式为C15H24O。HR-ESI-MSm/z:219.1825 [M-H]-(计算值219.1827),[α]25D=-14.2°(c0.44,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.44(1H,m,H-2a),1.63(1H,d,J=13.0 Hz,H-2b),2.62(1H,m,H-3a),2.40(1H,d,J=15.0 Hz,H-3b),2.62(1H,m,H-6a),2.28(1H,m,H-6b),1.86(1H,m,H-7),1.25(1H,m,H-8a),1.72(1H,m,H-8b),1.07(1H,m,H-9a),1.43(1H,m,H-9b),1.96(1H,m,H-10),0.80(3H,s,H-12),0.92(3H,s,H-13),4.15(2H,m,H-14),0.89(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:65.8(C-1),26.2(C-2),37.9(C-3),131.2(C-4),146.3(C-5),28.2(C-6),48.5(C-7),27.5(C-8,C-9),35.2(C-10),41.1(C-11),26.1(C-12),19.3(C-13),60.6(C-14),17.9(C-15)。以上数据与文献[10]报道基本一致,故鉴定化合物6为cyperenol。

化合物7:淡黄色油状,分子式为C15H22O2。HR-ESI-MSm/z:233.1623 [M-H]-(计算值233.1620),[α]25D=+5.2°(c0.78,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:2.11(2H,s,H-2),2.03(2H,dd,J=15.8,6.8 Hz,H-6),1.40~1.38(1H,m,H-7),1.02~0.98(1H,m,H-8a),1.56~1.47(2H,m,H-8b,H-10),0.91~0.84(1H,m,H-9a),1.13~1.07(1H,m,H-9b),0.46(3H,s,H-12),0.64(3H,s,H-13),0.8(3H,d,J=6.8 Hz,H-14),1.62(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:50.6(C-1),33.9(C-2),169.1(C-3),142.1(C-4),115.1(C-5),30.0(C-6),44.0(C-7),27.0(C-8),27.7(C-9),35.9(C-10),43.9(C-11),26.3(C-12),18.6(C-13),17.9(C-14),15.6(C-15)。以上数据与文献[11]报道基本一致,故鉴定化合物7为cyperolactone。

化合物8:无色针状,分子式为C15H24O。HR-ESI-MSm/z:219.1829 [M-H]-(计算值219.1827),[α]25D=-70.1°(c0.93,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.78(1H,t,J=10.0 Hz,H-1),1.45(1H,m,H-2a),1.64(1H,m,H-2b),2.09(1H,m,H-3a),0.90(1H,m,H-3b),2.89(1H,dd,J=10.6,4.2 Hz,H-5),2.23(1H,m,H-6a),1.32(1H,m,H-6b),2.36(1H,m,H-7a),2.11(1H,m,H-7b),2.59(1H,q,J=7.0 Hz,H-9),1.70(1H,m,H-10a),1.64(1H,m,H-10b),1.22(3H,s,H-12),4.99(1H,br.s,H-13a),4.88(1H,br.s,H-13b),1.0(3H,s,H-14),0.97(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:50.8(C-1),27.2(C-2),39.2(C-3),59.8(C-4),63.8(C-5),30.2(C-6),29.8(C-7),151.8(C-8),48.7(C-9),39.8(C-10),34.0(C-11),17.0(C-12),112.8(C-13),21.6(C-14),29.9(C-15)。以上数据与文献[12]报道基本一致,故鉴定化合物8为(-)-caryophyllene oxide。

化合物9:淡黄色固体,分子式为C15H24O。HR-ESI-MSm/z:219.1824 [M-H]-(计算值219.1827),[α]25D=0.0°(c0.85,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.99(1H,dd,J=13.5,9.6 Hz,H-1a),1.87(1H,dd,J=13.7,5.2 Hz,H-1b),5.00(1H,dd,J=9.5,6.7 Hz,H-2),2.20(1H,m,H-4a),2.10(1H,m,H-4b),2.10(1H,m,H-5a),1.37(1H,m,H-5b),2.52(1H,dd,J=10.1,3.8 Hz,H-6),2.57(1H,dd,J=12.4,5.2 Hz,H-8a),1.65(1H,dd,J=12.2,10.4 Hz,H-8b),5.31(1H,ddd,J=15.7,10.1,5.2 Hz,H-9),5.17(1H,d,J=15.8 Hz,H-10),1.10(3H,s,H-12),1.13(3H,s,H-13),1.31(3H,s,H-14),1.57(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:40.3(C-1),125.7(C-2),131.9(C-3),36.6(C-4),24.8(C-5),62.0(C-6),63.2(C-7),42.5(C-8),122.1(C-9),143.1(C-10),36.5(C-11),29.7(C-12),24.8(C-13),17.2(C-14),15.1(C-15)。以上数据与文献[13]报道基本一致,故鉴定化合物9为humulene epoxide Ⅱ。

化合物10:无色针晶,分子式为C15H24O2。HR-ESI-MSm/z:235.1773 [M-H]-(计算值235.1776),[α]25D=-2.2°(c0.43,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:2.48(1H,d,J=9.6 Hz,H-2),1.57(1H,d,J=10.8 Hz,H-3a),1.40(1H,m,H-3b),5.31(1H,d,J=15.9 Hz,H-5),5.49(1H,ddd,J=15.6,10.5,4.8 Hz,H-6),2.64(1H,dd,J=12.5,5.1 Hz,H-7a),1.64(1H,dd,J=14.1,11.1 Hz,H-7b),2.74(1H,dd,J=9.9,5.1 Hz,H-9),2.20(1H,ddd,J=14.1,10.5,5.1 Hz,H-10a),1.40(1H,m,H-10b),2.14(1H,ddd,J=7.5,5.4,1.8 Hz,H-11a),1.08(1H,m,H-11b),1.31(3H,s,H-12),1.19(3H,s,H-13),1.08(3H,s,H-14),1.31(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:60.0(C-1),64.6(C-2),38.3(C-3),35.6(C-4),142.8(C-5),122.5(C-6),43.3(C-7),63.3(C-8),60.3(C-9),25.1(C-10),34.8(C-11),16.4(C-12),23.4(C-13),30.7(C-14),16.5(C-15)。以上数据与文献[14]报道基本一致,故鉴定化合物10为 humulene diepoxide A。

化合物11:淡黄色油状,分子式为C29H50O2。HR-ESI-MSm/z:429.3813 [M-H]-(计算值429.3811),[α]25D=+7.2°(c0.65,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.24(3H,s,H-2a),1.75(2H,m,H-3),2.58(2H,t,J=6.8 Hz,H-4),2.19(3H,s,H-7a),2.14(6H,s,H-5a,8a),0.83(3H,d,J=6.4 Hz,H-4'a),0.83(3H,d,J=6.4 Hz,H-8'a),0.88(3H,d,J=6.8 Hz,H-12'a),0.86(3H,d,J=6.8 Hz,H-13');13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:74.5(C-2),23.8(C-2a),31.6(C-3),20.7(C-4),118.4(C-5),11.2(C-5a),144.5(C-6),121.0(C-7),12.1(C-7a),122.6(C-8),11.7(C-8a),145.6(C-9),117.3(C-10),39.8(C-1'),21.0(C-2'),37.5(C-3'),32.8(C-4'),19.7(C-4'a),37.4(C-5'),24.4(C-6'),37.4(C-7'),32.7(C-8'),19.6(C-8'a),37.3(C-9'),24.7(C-10'),39.4(C-11'),27.9(C-12'),22.7(C-12'a),22.6(C-13')。以上数据与文献[15]报道基本一致,故鉴定化合物11为α-tocopherol。

化合物12:白色无定形粉末,分子式为C15H22O2。HR-ESI-MSm/z:233.1623 [M-H]-(计算值233.1620),[α]25D=+6.2°(c0.82,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:6.67(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),6.86(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-2),6.83(1H,d,J=2.0 Hz,H-4),2.60(1H,ddd,J=12.0,8.3,3.6 Hz,H-6),2.10(1H,m,H-7a),1.73(1H,m,H-7b),2.22(1H,ddd,J=15.8,7.7,5.3 Hz,H-8a),2.16(1H,dd,J=15.8,8.0 Hz,H-8b),1.85(1H,m,H-11),1.01(3H,d,J=6.8 Hz,H-12),0.73(3H,d,J=6.8 Hz,H-13),2.05(3H,s,H-14),2.25(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:115.8(C-1),127.4(C-2),129.9(C-3),128.7(C-4),130.0(C-5),44.5(C-6),26.8(C-7),42.0(C-8),210.9(C-9),152.1(C-10),33.1(C-11),21.0(C-12),21.4(C-13),30.2(C-14),20.9(C-15)。以上数据与文献[16]报道基本一致,故鉴定化合物12为litseachromolaevane A。

化合物13:淡黄色油状,分子式为C15H24O2。HR-ESI-MSm/z:235.1773 [M-H]-(计算值235.1776),[α]25D=-1.2°(c0.78,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:3.13(1H,dd,J=9.1,5.9 Hz,H-1),2.31(1H,m,H-2a),1.51(1H,m,H-2b),2.17(1H,m,H-3a),1.21(1H,m,H-3b),2.89(1H,dd,J=10.7,3.8 Hz,H-5),2.11(1H,td,J=13.2,3.8 Hz,H-6a),1.27(1H,m,H-6b),1.99(1H,m,H-7),1.69(1H,m,H-8a),1.58(1H,m,H-8b),2.21(1H,dd,J=13.9,6.2 Hz,H-9a),1.10(1H,dd,J=13.9,12.3 Hz,H-9b),4.65(1H,br.s,H-12a),4.61(1H,br.s,H-12b),1.70(3H,s,H-13),1.32(3H,s,H-14),1.37(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:60.4(C-1),24.9(C-2),34.7(C-3),59.6(C-4),63.7(C-5),33.2(C-6),45.0(C-7),28.6(C-8),41.0(C-9),60.0(C-10),150.1(C-11),108.9(C-12),19.7(C-13),16.8(C-14),15.8(C-15)。以上数据与文献[17]报道基本一致,故鉴定化合物13为hyperhubein G。

化合物14:淡黄色油状,分子式为C15H22O。HR-ESI-MSm/z:217.1675 [M-H]-(计算值217.1671),[α]25D=+200.2°(c0.68,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:5.78(1H,s,H-1),4.72(1H,br.s,H-12a),4.74(1H,br.s,H-12b),1.74(3H,br.s,H-13),1.13(3H,s,H-14),0.97(3H,d,J=3.7 Hz,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:124.6(C-1),199.6(C-2),42.1(C-3),40.3(C-4),39.3(C-5),32.9(C-6),40.4(C-7),31.6(C-8),43.9(C-9),170.5(C-10),149.1(C-11),109.2(C-12),20.9(C-13),14.9(C-14),16.8(C-15)。以上数据与文献[18]报道基本一致,故鉴定化合物14为nootkatone。

化合物15:白色无定形粉末,分子式为C15H22O。HR-ESI-MSm/z:217.1673 [M-H]-(计算值217.1671),[α]25D=+0.4°(c0.64,CHCl3)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:2.65(1H,dd,J=6.7,1.3 Hz,H-1),5.71(1H,m,H-3),1.96(1H,dd,J=6.7,0.9 Hz,H-5),2.64(1H,s,H-6),1.70(1H,m,H-7),1.50(1H,ddd,J=2.8,10.5,10.5 Hz,H-8a),1.70(1H,m,H-8b),1.85(1H,m,H-9a),1.70(1H,m,H-9b),1.48(1H,dd,J=6.5,6.5 Hz,H-11),0.83(3H,d,J=6.5 Hz,H-12),0.81(3H,d,J=6.5 Hz,H-13),1.98(3H,d,J=1.4 Hz,H-14),0.94(3H,s,H-15);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:56.6(C-1),203.5(C-2),121.4(C-3),169.5(C-4),55.9(C-5),54.6(C-6),45.4(C-7),21.9(C-8),36.7(C-9),57.0(C-10),31.7(C-11),19.4(C-12),19.9(C-13),20.2(C-14),23.5(C-15)。以上数据与文献[19]报道基本一致,故鉴定化合物15为mustakone。

3.2 化合物生物活性测试结果

采用CCK-8法测定化合物1~15对LPS诱导小鼠BV-2细胞存活率的影响,发现15个化合物在浓度为50 µmol·L-1时,细胞存活率均高于90%。15个化合物在终浓度为50 µmol·L-1时对LPS诱导的BV-2细胞的炎症反应结果如表1所示。化合物4和11可显著抑制NO的释放,提示化合物4和11具有一定的抗炎活性,为后续抗炎机制研究奠定基础。

表1 化合物1~15对LPS诱导的BV-2细胞产生NO的抑制效果Tab 1 Inhibition of compounds 1~15 on NO production in LPSinduced BV-2 microglial cells

4 讨论

本研究首次使用制备型正相HPLC技术对香附石油醚层进行系统分离,得到15个化合物,其中化合物2、6、9~11和13为首次从莎草科植物中分离得到,化合物12为首次从莎草属植物中分离得到,化合物4、5和7为首次从香附中分离得到,制备型正相HPLC解决了小极性化合物不溶于甲醇或乙腈而造成的损失。NO是目前广泛被认可的炎症因子,标志着免疫细胞的激活。LPS可以刺激BV-2细胞产生炎症反应,并增加细胞中NO的生成,直接参与炎症的发生与发展。本实验测定了15种化合物对LPS诱导小鼠BV-2细胞释放NO的抑制率,同时进行了CCK-8检测。结果显示,化合物4和11能显著抑制NO的生成。本实验结果丰富了香附的化学成分,可为香附的进一步开发利用提供参考。

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