蒙药三子散多指标成分的含量测定

2024-03-14 03:48许佳绮刘妍妍白云霞刘宏夏慧敏张慧文王焕芸内蒙古医科大学药学院呼和浩特000濮阳市安阳地区医院药学部河南安阳455000内蒙古科技大学包头医学院内蒙古包头0400
中南药学 2024年2期
关键词:鞣酸诃子栀子

许佳绮,刘妍妍,白云霞,刘宏,夏慧敏,张慧文*,王焕芸*(.内蒙古医科大学药学院,呼和浩特 000;.濮阳市安阳地区医院药学部,河南 安阳 455000;.内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古 包头 0400)

中蒙药复方制剂的成分复杂,且发挥作用的并非单一的化学成分,而是多种成分相互作用的结果。近年来,中蒙药的质量评价已经从单一指标的检测发展到基于多指标成分的综合质量评价,伴随着数据量的增加,需要借助更科学的化学计量学方法进行分析。灰色关联度分析(grey relational analysis,GRA)是一种多因素统计分析的方法,此方法对数据要求较低,且计算量小,常用于中药质量控制、谱效分析中。逼近理想解排序法(technique for order preference by similarity to ideal solution,TOPSIS)是一种综合评价方法,通过将多个指标计算整合为一个综合指标,把多维问题转化为一维问题,降低了分析过程中不同类型指标对决策的干扰及实验过程中人为因素产生的干扰,从而提高多目标决策分析的科学性和准确性[1]。TOPSIS方法与中药指纹图谱技术和多维分析技术的合理整合是一种综合鉴别、客观量化和精准评价中蒙药质量[2-3]、药效[4]、临床应用[5]的有效方法,更能清晰、准确地揭示中蒙药复杂系统的真实本原。

三子散现收载于2020年版《中国药典》一部,为蒙古族传统方剂之一,由诃子、栀子、川楝子三味药材等量配比混合而成[6]。现行的三子散含量测定仅以单指标测定有效成分没食子酸[7]、川楝素[8]、还原糖[9]的含量为主,本课题组前期对三子散进行研究[10-12],发现其入血成分为酚酸类、鞣质类、环烯醚萜类等化学成分。基于此,为了更系统地评价三子散质量,本试验在前期HPLC指纹图谱研究的基础上,纳入了更多能反映蒙药三子散整体质量属性、与药效关联性较强的化合物作为复方含量测定指标,即酚酸类(没食子酸、咖啡酸)、环烯醚萜类(京尼平苷)、鞣质类(诃子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、诃子鞣酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖、诃子林鞣酸、鞣花酸)、单萜苷类(jasminoside B)。采用HPLC技术建立上述12种成分的含量测定方法,结合GRA-TOPSIS法建立15批三子散的质量评价模型,以期为不同批次、不同产地中蒙药材的质量评价提供更加全面、科学的参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030C 3D型高效液相色谱仪(日本株式会社岛津制作所),PX225DZH型十万分之一天平(奥豪斯仪器有限公司),JJ224BC型万分之一电子天平(常熟市双杰测试仪器厂),WK-1000A型小型高速粉碎机(潍坊市北方制药设备制造有限公司),PF3XXXXM1型一体化超纯水系统(英国ELGA公司)等。

1.2 试药

对照品没食子酸(批号:D2016091,纯度:99%)、京尼平苷(批号:J2027132,纯度≥98%)、咖啡酸(批号:I2002097,纯度:98%)、鞣花酸(批号:K1813148,纯度:96%)(阿拉丁试剂有限公司);石榴皮鞣素(批号:M23J11S119104,纯度≥98%)、诃子次酸(批号:M30GB150105,纯度≥95%)、柯里拉京(批号:P25A11S122217,纯度≥98%)、安石榴苷(批号:Y11S11Y124050,纯度≥98%)、诃子鞣酸(批号:M29GB143373,纯度≥98%)、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖(批号:P16M11F113433,纯度≥99%)、诃子林鞣酸(批号:P24J9F53640,纯度≥98%)(上海源叶生物科技有限公司);jasminoside B(批号:P16A9F58571,纯度≥98%,北京谱析科技有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯,甲酸、磷酸为分析纯,水为超纯水。

诃子、栀子、川楝子单味药饮片各15批,经内蒙古医科大学生药教研室张慧文博士鉴定,诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果实,栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实,川楝子为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果实,均符合2020年版《中国药典》一部标准。将各批次诃子、栀子、川楝子单味药饮片使用粉碎机粉碎成粗粉,过40目筛,取三味药材等比等量混匀,随机取样组合,即得15批三子散样品(编号S1~S15),各单味药饮片来源信息详见表1。

表1 15批三子散中各单味药饮片来源Tab 1 Source of each single medicine piece in 15 batches of Sanzi powder

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~5 min,1%→5%B;5~10 min,5%→13%B;10~24 min,13%→23%B;24~56 min,23%→35%B;56~78 min,35%→47%B;78~90 min,47%→85%B;90~100 min,85%→90%B;100~105 min,90%→100%B);柱温为30℃;流速为1.0 mL·min-1;检测波长为254 nm;进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品储备液 精密称取对照品诃子次酸、没食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、诃子鞣酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖、诃子林鞣酸、鞣花酸适量,置于同一量瓶中,加甲醇溶解并定容,混匀,制备成质量浓度分别为470、250、94、1030、1320、154、540、1800、2870、450、2610、550 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取三子散样品1.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入甲醇25 mL,摇匀,称量,超声提取30 min,放至室温后再次称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,4℃条件避光保存,0.45 μm滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 缺味阴性样品溶液 以1.2 g为处方总量,分别配制不含诃子或栀子或川楝子的缺味阴性样品处方,并按“2.2.2”项下方法处理,即得各缺味阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取混合对照品、供试品、缺味阴性样品、空白溶液适量,进样测定,记录色谱图,结果见图1。供试品溶液中12种成分的色谱峰分离度良好,理论板数较高;供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有对应色谱峰,供试品溶液及各缺味阴性样品溶液中其他成分色谱峰对12种成分测定均无干扰,空白溶液于相同保留时间处无干扰,表明该方法专属性良好。

图1 三子散HPLC图Fig 1 HPLC of Sanzi powder

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液适量,置于不同量瓶中,加甲醇定容,摇匀,得一系列浓度对照品溶液,进样测定,记录各色谱峰峰面积值(其中,安石榴苷峰面积为安石榴苷A与安石榴苷B峰面积之和)。以对照品溶液质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程,结果见表2,12种成分在各自质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表2 12种成分的回归方程及线性范围Tab 2 Linear regression equation and linear range of 12 components

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”混合对照品溶液适量,连续进样测定6次,结果12种成分峰面积的RSD均在0.11%~0.46%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取三子散样品(S14),按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,进样测定,记录峰面积并根据外标法计算12种待测成分的含量,结果12种成分含量的RSD在0.80%~2.8%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份三子散样品(S14),按“2.2.2”项下方法制备,分别于室温下放置0、3、6、9、12、24、48 h进样测定,计算得到12种成分峰面积的RSD在1.2%~2.8%(n=7),表明供试品溶液于室温下放置48 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收试验 精密称取各成分已知含量的三子散样品约0.50 g,平行称定9份,分别精密加入相当于该样品中各待测成分含量0.8、1.0、1.2倍量的单一成分对照品溶液,每个质量浓度平行操作3份,按“2.2.2”项下方法制备,进样测定,计算12种成分的平均加样回收率及RSD。结果显示12种成分的平均回收率为96.72%~104.07%,RSD为1.4%~2.6%(n=3),表明本方法的准确度良好。

2.4 样品含量测定

取15批三子散样品(S1~S15),按“2.2.2”项下方法制备,在“2.1”项色谱条件下进样测定,记录峰面积,以外标法计算12种待测成分的含量,每份样品平行操作3次,取平均值,结果见表3。15批三子散样品中诃子次酸、没食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、诃子鞣酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖、诃子林鞣酸、鞣花酸的平均含量分别为2.977~7.763、0.8465~2.487、0.2872~1.208、3.897~11.68、2.356~16.46、0.7995~1.444、2.492~4.870、13.28~21.39、14.50~26.46、1.766~4.165、3.406~27.50、3.064~7.078 mg·g-1。

表3 12种成分的含量测定结果(mg·g-1,n=6)Tab 3 Content of 12 components (mg·g-1,n=6)

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 TOPSIS分析[13-14]设有m个评价对象,n个评价指标(m=1,2,……i;n=1,2,……j),本试验中m=15,n=12,将其检测数据构成矩阵V,由于样品中各测量成分含量不一,需要按照公式(1)将矩阵V进行归一化处理,得到矩阵Z。

注:zij表示第i个评价对象在第j个指标上的取值。

根据归一化矩阵结构选出最优方案和最劣方案,最优方案Z+为n个评价指标对应样品的最大值最优方案;Z-为n个评价指标对应样品的最小值,具体见公式(2)、(3)。

按照公式(4)、(5)计算各评价对象与最优方案和最劣方案之间的距离。

按照公式(6)计算各评价对象与最优方案的相对接近程度(Ci),0<Ci<1

按照大小将各评价对象排序,Ci值越大,说明评价对象综合质量越好,结果见表4。

表4 15批次三子散GRA与TOPSIS分析结果Tab 4 GRA and TOPSIS analysis of 15 batches of Sanzi powder

2.5.2 GRA[15]基于15批次三子散12种成分的含量,建立灰色模式识别数据集,由于其量纲不统一,对原始数据进行规格化处理。设有m个样品,每个样本有n项评价指标,组成评价单元序列{Xik}(i=1,2…,m;k=1,2,…,n),本试验按照公式(7)对不同批次三子散数据进行规格化处理。

其中,Yik为规格化处理后的数据,Xik为原始数据,Xk为m个样品第k个指标的均值。

采用GRA进行评价时,需要考虑最优参考序列和最差参考序列。最优参考序列为{Xsk}(k=1,2,…,n)是m个样品对应指标的最大值;最差参考序列为{Xtk}(k=1,2,…,n),是m个样品对应指标的最小值。

最优参考序列关联系数见公式(8):

式中,Δmin=min|Yik-Ysk|,Δmax=max|Yik-Ysk|,Yik为各个成分对应的Yik的最大值,ρ为分辨系数,通常取值0.5。

最差参考序列关联系数见公式(9):

式中,Δmin=min|Yik-Ysk|,Δmax=max|Yik-Ysk|,Ytk为各个成分对应的Yik的最小值,ρ为分辨系数,通常取值0.5。

最优参考序列关联度见公式(10):

最差参考序列关联度见公式(11):

相关关联度见公式(12):

计算各样品的相对关联度,并且按ri大小排序,排序结果见表4。

由表4所示,GRA和TOPSIS分析结果基本一致,根据TOPSIS分析所得Ci值以及排序可知,排在前8位的是S12、S15、S3、S6、S1、S4、S14、S10,GRA分析所得ri值以及排序可知,排在前8位的是S15、S6、S3、S10、S14、S12、S1、S4。两种分析结果均表明,Ci值及ri值排名均靠后的样品是S13、S11、S7,表明这3批样品的综合质量相对较差。

3 讨论

3.1 含量测定指标的选择

蒙药三子散由诃子、栀子、川楝子三味药材等量配比混合而成。研究表明酚酸类没食子酸、莽草酸,鞣质类诃子酸、鞣花酸、黄酮类、三萜类等是诃子的主要活性成分[16]。栀子的化学成分包括环烯醚萜类京尼平苷、栀子苷,单萜苷类jasminoside B,有机酸类咖啡酸等多种化合物,其中环烯醚萜是栀子主要的生物活性成分[17]。川楝子中含有多种类型的化合物,包括三萜、木脂素、黄酮及其他类成分[18],三萜类化合物是其发挥药效主要的活性成分,但三萜类化学成分紫外吸收较弱或存在末端吸收,因此在本试验条件下诃子和栀子中的化学成分对其干扰大,难以对其准确定量,同时,考虑到方中三味药材均含有黄酮类成分,成分专属性不强。在课题组前期三子散HPLC 指纹图谱研究的基础上,结合化学模式识别分析结果[12],选定诃子中没食子酸、诃子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、诃子鞣酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖、诃子林鞣酸、鞣花酸,栀子中京尼平苷、jasminoside B、咖啡酸这12 种含量较高的成分作为三子散含量测定的指标成分。

3.2 结果评价

从15批三子散样品中12种待测成分的含量测定结果来看,各成分含量均存在一定的批间差异,分析其原因可能是中蒙药含量易受药材产地、生长环境、采收期等影响,导致其内在质量产生了很大差异。15批三子散中诃子鞣酸、京尼平苷含量较高,jasminoside B、诃子林鞣酸含量差距较大,GRA和TOPSIS分析结果基本一致,根据TOPSIS分析所得Ci值和GRA分析所得ri值可知,样品编号为S1、S3、S4、S6、S10、S12、S14、S15在所有样品中排名前8,这为区分不同批号的产品提供了一种有效的方法。

综上所述,本研究采用HPLC法同时测定三子散中12种活性成分的含量,并尝试将GRA分析法与 TOPSIS 数学模型结合对不同批次三子散含量检测数据进行综合评价。该方法准确、简便,具有多重质量控制效果,可以为三子散在生产、储存及检验等过程中的质量控制提供方法和依据,为进一步完善三子散的质量标准提供参考。

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