基于网络药理学分析中药治疗高脂血症作用机制 *

徐慧文 徐 玥 姚寒俊 叶晓颖 李诗涵 蔡 羽

（湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065）

血脂是血清胆固醇、三酰甘油和类脂等物质的总称，与临床密切相关的血脂主要是胆固醇和三酰甘油。近30年来，我国高脂血症患病率明显增加［1］。据统计［2］，我国18岁及以上居民高脂血症总体患病率高达35.6%，已造成严重的疾病负担。本课题组前期基于数据挖掘研究中医药治疗高脂血症的用药规律，找出5个中药组合，其中最有效的组合是山楂、何首乌、丹参、决明子、泽泻。中医药治疗高脂血症有独特的优势，如药源丰富，毒副作用小，有多种保肝降脂作用途径，能够灵活组方、因人制宜等，具有广阔的应用前景［3］。网络药理学可以分析组方潜在作用机制［4］。基于此，本研究使用网络药理学和分子对接的方法，讨论中医药治疗高脂血症的作用机制。

1 研究方法

1.1 收集高脂血症疾病相关靶点使用GeneCards 数据库和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库，以“Hyperlipidemia”为关键词进行检索，获取与高脂血症相关的蛋白靶点；合并数据，删除重复或无效的基因。

1.2 筛选方剂的活性成分及成分靶点使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库，筛选条件为口服生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18，分别以“山楂”“何首乌”“丹参”“决明子”“泽泻”为关键词进行检索，获取所有活性成分，同时收集相应靶点；使用UniProt 数据库进行靶点、基因名称的标准化，删除无注释及重复靶点。

1.3 筛选药物成分和疾病共有靶点使用R 软件将收集到的药物成分靶点与疾病靶点映射筛选，得出共同靶点并绘制韦恩图。

1.4 构建蛋白互作（PPI）网络把共同靶点导入String数据库，设置研究物种为人类，结果可信度选择高（High confidence），删除网络中未与其他基因靶点有互作关系的基因靶点，构建PPI网络。

1.5 基因本体论（GO）功能富集运用R 脚本、id2symbol.pl脚本、id.txt 文件，在GO 数据库里通过每个id 找各基因的功能，并统计每个功能上有多少个基因，行Fisher 检验，从而得出各基因是否在某个功能上富集。统计值越小，说明富集程度越高。

1.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集向KEGG 网站上传目标基因的氨基酸序列FASTA 文件，选择动物物种类别，并用R软件将结果可视化。

1.7 分子结构对接验证从中医药百科全书数据库（ETCM）中下载高频中药成分的3D 结构式，并从Swissmodel 数据库中下载关键靶点的结构片段。将每一个成分的结构式和靶点的结构片段录入SwissDock 网站，进行分子对接。

2 结果

2.1 药物成分与疾病共有靶点的筛选通过TCMSP数据库，得到中药组合（山楂、何首乌、丹参、决明子、泽泻）136个成分、396个靶点；通过GeneCards及OMIM数据库，得到501个疾病靶点。使用R软件将具有潜在作用的药物成分靶点基因同疾病靶点基因进行匹配映射，得到共有靶点基因37个，为该药物组合治疗高脂血症的潜在作用靶点。

2.2 PPI网络的构建及核心靶点的筛选药物-疾病共有靶点PPI 网络共有37 个节点，核心靶点有肿瘤坏死因子（TNF）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARG）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）。见图1。

图1 药物-疾病共有靶点PPI

2.3 GO富集分析GO 功能富集主要分为生物学过程、细胞组成以及分子功能3个部分，根据矫正后P-value 值进行从小到大排序，分别选取前10个富集条目。生物学过程主要包括生物质量的调节、脂质代谢过程、对外刺激的反应等；细胞组成主要包括膜约束的细胞器；分子功能主要包括类固醇绑定、激素结合、脂质结合等。

2.4 KEGG富集通路分析对该药物组合治疗高脂血症的37个关键靶点基因进行KEGG通路富集分析，共得到63条通路，其关键靶点主要富集于过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路和流体剪应力与动脉粥样硬化。

2.5 分子对接验证把选取的3 个关键靶点激素敏感脂酶（LIPE）、PPARG、EGFR 和已有的高频中药成分的3D 结构录入SwissDock 网站，进行分子对接。靶点与高频中药成分配体结合的构象稳定时，能量越低发生的作用可能性越大，通常结合能＜-7.0 kcal/mol 表示具有较好的结合活性［5］。而在统计的高频中药与这3 个靶点的2889 种结合方式中，有1679 种分子对接结果的结合能＜-7.0 kcal/mol，这说明有一半及以上的分子对接有较好的结合活性。其中结合性最强的，是与PPARG靶点结合的橙皮素-7-氧-芦丁苷。见表1。

表1 关键靶点与其结合最紧密成分的分子对接

3 讨论

中医将高脂血症纳入“血瘀”“痰湿”“脂膏”等范畴，认为其病因为饮食不节、嗜食油腻甘甜等，造成肝、脾、肾三脏功能失调，体内液体代谢失常，最终致病［1］。本研究采用网络药理学的方法分析药物的活性成分、靶点，疾病的靶点，并通过疾病与药物的交集靶点进行功能和通路的分析。结果显示，治疗高脂血症的中药组合（山楂、何首乌、丹参、决明子、泽泻），其最核心的交集靶点是TNF，其次是PPARG、EGFR。TNF作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管受损，形成血栓［6］。PPARG基因编码的蛋白质PPAR-γ 是脂肪细胞分化的调节器［7］。EGFR 下降时，平均动脉压力（MAP）也下降［8］。GO 富集分析发现，该组合最主要的生物学过程是生物质量的调节，最主要的细胞组成是膜约束的细胞器，最主要的分子功能是脂质结合。将交集靶点进行KEGG 通路分析，发现该药物组合作用于高脂血症最主要的通路是对脂肪细胞脂溶解的调节。其中三酰甘油被脂肪酶水解释放出甘油和游离脂肪酸，甘油磷脂通过磷脂酶A1、A2、C、D生成甘油和脂肪酸；甘油经甘油激酶和3-磷酸甘油脱氢酶生成磷酸二羟丙酮，脂肪酸则主要通过β-氧化生成二氧化碳、水和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）［9］。其次是胰岛素抵抗、流体剪应力与动脉粥样硬化。流体剪应力为与血管壁平行的血液流动的单位表面积的摩擦力，流区低水平剪应力（＜4 dynes/cm2）可促进粥样硬化的发生及斑块形成，而某一范围内的高水平剪应力（10～70 dynes/cm2）则会对抗动脉粥样硬化的发生［10-12］。此外，分子对接结果显示，关键靶点LIPE为激素敏感脂酶，能水解多种酯，并在酰基甘油的脂肪酸代谢中起关键作用，极大地促进脂类物质的代谢［13］。而PPARG 基因编码的蛋白质PPARγ 可以调节脂肪细胞的分化，当脂肪细胞分化受到抑制时，人体的脂肪组织和脂肪细胞的体积会相应减少［7］。EGFR 可以扩张血管使血压降低，从而使脂类物质不易堆积在血管中，进而减轻高血脂堵塞血管的危害。所有高频中药中，一半以上的成分都可以与高脂血症的关键靶点很好地结合，说明每个高频中药对治疗高脂血症均有不同程度的作用，为后续使用单味中药治疗高脂血症以及后人用这些高频中药重组新方治疗该病提供了一定的指导意义。而高频中药陈皮中的橙皮素-7-氧-芦丁苷与PPARG靶点的结合性最强，提示其对高脂血症可以发挥最稳定的药理作用。虎杖中的芦丁与LIPE靶点也能较好结合，提示其治疗高脂血症的特征成分有芦丁及芦丁类似物，同时它们可以防治血管内皮损伤，减少甚至消除高血脂对血管内皮的损伤［14］。

综上所述，文章采用网络药理学和分子对接的方法，分析了治疗高脂血症最有效中药组合（山楂、何首乌、丹参、决明子、泽泻）可能作用的潜在靶点、生物学过程、细胞组成、分子功能、信号通路，并进一步总结出其可能存在的作用机制，验证了高频中药成分和关键靶点分子对接具有良好的契合度。该药物组合可能通过促进脂质代谢、抑制脂肪细胞分化来减少脂质、扩张血管，从而减少血管堵塞，缓解高血脂对血管内皮的损伤。