GGT5通过PI3K-MAPK通路调控胃癌细胞的增殖与迁移

杨帆帆 章浙忠 黄慧 许嘉 陈瑾 许健*

胃癌（Gastriccancer，GC）是世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居全球第5 位和第4位［1］。2020 年，全世界有100 多万例胃癌新发病例和76.9 万例死亡［2］。虽然病理学检测是诊断胃癌的金标准，但具有一定的滞后性，同时实验室缺乏针对早期胃癌特异性的生物学标志［3］。γ-谷氨酰转移酶（Gammaglutamyltransferase，GGT）是一种多基因编码的膜结合细胞外酶［4］，GGT1 和GGT5 是仅有的两种裂解γ-谷氨酰键的细胞外酶［5］。GGT5 是迄今为止发现的唯一具有催化活性的GGT 酶，参与控制再氧化、药物代谢、免疫功能［6］等机体功能。虽然GGT 是常规生化检测项目，但有文献表明GGT5 可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。本研究通过生物信息学分析［7］GGT5 在胃癌中的表达以及体外实验检测GGT5 敲低对胃癌细胞增殖迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析 从UCSC 数据库下载泛癌数据集：TCGAPan-cancer，提取每个样本GGT5 基因表达数据，在Sangerbox 中分析GGT5 在不同肿瘤中的表达及其与预后、免疫浸润、临床分期的关系。从GEO 数据库获得GSE 数据集；利用LinkedOmic 数据库研究GGT5 与GC 中其他基因的相关性。使用ClusterProfiler 对GGT5进行GO 功能分析并富集KEGG 通路，LinkedOmic 进行基因集富集分析。

1.2 临床信息 选取浙江省中医院近3 年诊治的原发性胃癌患者124 例，纳入标准为所有均行内镜、剖腹或腹腔镜手术切除患者，术前均未接受过任何胃癌治疗者，无癫痫药物服用史者，5 年内无其他恶性肿瘤者。选取近1年内进行健康体检的287例人员作为健康对照组，纳入标准为血脂无异常、肿瘤标志物正常、未诊断其他疾病者。收集胃癌患者术前和健康对照组的生化指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和谷氨酰转肽酶（GGT），分析GGT 的差异（排除肝功能异常：ALT 男性为5～40 U/L，女性为5～35 U/L；AST8～40 U/L）。本研究遵循的程序符合浙江省中医院伦理委员会批准。

1.3 细胞培养 HGC-27 和AGS 在10% 胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的RPMI-1640 培养基中培养，MKN-45 在10%FBS 的DMEM 培养基中培养。细胞置于37℃、5%CO2的湿化培养箱中培养。

1.4 细胞转染 该慢病毒载体具有绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）基因和嘌呤霉素抗性的特性。在6 孔板加入细胞至24 h 后融合至70%时，去除旧培养基，加入1 mL GGT5 敲降慢病毒（shGGT5，序列为GCTCTTCTTCAACGGGACAGA）悬液。同时用对照阴性慢病毒（shNC，序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT）建立对照细胞系。当GFP 表达良好且生长稳定时，加入2μg/mL 嘌呤霉素选转染不良的细胞。

1.5 RNA 提取和qPCR 检测GGT5 敲降后表达水平 Trizol 法提取细胞总RNA 后逆转录成cDNA， 之后进行qPCR 检测。 引物序列GAPDH：Forward5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'Reversed5'-TCCACCACCCTGTTGCTGT-3' ；GGT5 ：F5'-GTCAGCCTAGTCCTGCTGG-3'R5'-GGATGGCTCGTCCAATATCCG-3'。数据分析采用2-ΔΔCt方法。

1.6 CCK-8 检测胃癌细胞的增殖 每孔3,000 个细胞接种至96 孔板中培养24 h、48 h、72 h 后每孔1 ∶10加入CCK-8 试剂，37℃孵育2 h 后，测定450 nm 处吸光度值。

1.7 EdU 检测胃癌细胞的增殖 将5×105个细胞悬液注入6 孔板内待细胞培养过夜恢复正常状态后进行EdU 实验，荧光显微镜检测增殖水平。

1.8 Transwell 和划痕实验观察胃癌细胞的迁移 将5×104个细胞悬液注入1%FBS 培养基中饥饿培养24 h 后再次消化细胞，接种200 μL 2×104细胞悬液于Transwell 小室，置于24 孔板中10% FBS 培养基的下室培养24 h。在划痕实验中，将5×105细胞悬液接种至6 孔板中，24 h 后，用无菌的移液管尖端在单层细胞中划痕。于0 h、24 h 时在6 孔板相同位置显微镜下观察划痕创面。

1.9 Western-blot 检测蛋白表达 采用RIPA 裂解缓冲液提取细胞中的蛋白煮沸变性后经SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温2 h 封闭，TBST 洗膜10 min 3 次，一抗4℃孵育过夜（表1）。次日使用对应二抗室温孵育2 h，ECL 化学发光试剂显影成像。

表1 一抗信息

1.10 统计分析 采用SPSS25.0 软件、Graph Pad Prism8 进行统计分析和绘图。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GGT5 在胃癌中的表达上调及其与临床病理参数的关系 SPSS 分析结果显示GGT 在胃癌患者中呈高表达（P＜0.05）（图1A、表2）。TCGA 和GES 数据库进一步证实作者的结果，GGT5 在胃癌组织中呈高表达（图1B-G），GGT5 高表达的患者预后明显较差（图1H）。GGT5 在晚期肿瘤标本中表达明显升高，且与胃癌的免疫浸润呈正相关（图2A-D）。数据库分析显示，GC 的发生与性别和年龄无关（图2E-F）。差异表达分析得到806 个差异表达基因，802 个表达上调，4 个表达下调（图2I）。EMILIN1、HIC1、C1R 和TMEM119 等基因与GGT5 呈正相关，LRPPRC、MELK、MAD2L1 和UCHL5等与GGT5 呈负相关（图2G-H）。功能富集分析显示，差异基因产物的分子功能主要与血管发育和血管生成的调节、细胞运动和迁移的调节、细胞外基质组织有关（图2J-K）。

图1 GGT5在胃癌中表达上调。A. 临床胃癌患者血清GGT水平；B-F. GES数据库胃癌组织中GGT5的表达；G. GGT5在TCGA数据库胃癌组织中的表达；H. GGT5表达与预后的关系。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

图2 GGT5在胃癌中的潜在功能。A-C. GGT5表达与临床分期关系；D. GGT5与胃癌免疫浸润的关系；E-F. 胃癌发生与性别年龄关系；G-H. 与GGT5呈正/负相关的显著基因；I. 差异表达基因火山图；J. GGT5的GESA功能富集分析；K. GGT5的KEGG通路分析和GO分析

表2 对胃癌患者和健康对照者的临床资料进行统计分析

2.2 GGT5 低表达降低胃癌细胞的增殖能力 为明确GGT5 对胃癌的作用，首先荧光显微镜观察转染shNC和shGGT5 荧光效率达75%。qPCR 结果显示，在GC 细胞中转染shGGT5 后，GGT5 的表达明显降低（图3AB）。EdU 和CCK8 实验检测发现shGGT5 胃癌细胞的增殖能力受到抑制（图3C-D）。

图3 GGT5低表达降低胃癌细胞增殖。A. GFP转染效率；B. qPCR检测转染效率；C. CCK8检测细胞增殖；D. EdU检测细胞增殖。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 GGT5 低表达下调PI3K/AKT-MAPK 信号通路抑制胃癌细胞增殖 与对照组相比，shGGT5 处理后P38 和ERK 的磷酸化水平明显降低（P＜0.001），AKT、P-AKT、PI3KP85 和P-PI3KP85 蛋白表达降低（P＜0.001）。此外，GGT5 敲低后，核转录因子STAT5b 的表达被抑制（P＜0.001）（图4）。结果表明，GGT5 的低表达可以通过调节PI3K/AKT-MAPK 信号通路影响胃癌的进展。

图4 低水平GGT5表达通过下调PI3K/AKT-MAPK信号通路抑制胃癌细胞增殖。***P＜0.001

2.4 敲低GGT5 抑制胃癌细胞的迁移 划痕实验结果显示，敲低GGT5 后胃癌细胞的迁移能力减弱（P＜0.001）。Transwell 检测细胞迁移能力结果与划痕实验结果一致（P＜0.001）（图5A-B）。Western-blot 结果显示，当GGT5 被敲低时，MMP2（P＜0.01）、MMP9（P＜0.01）和EGFR（P＜0.01）的表达降低（图5C）。

图5 敲降GGT5抑制胃癌细胞的迁移。A. 划痕实验检测细胞的迁移能力；B. Transwell验证胃癌细胞的迁移能力；C. Western blot检测MMPs通路。**P＜0.01，***P＜0.001

3 讨论

早期胃癌可采用内镜下黏膜切除或剥离术治疗预后良好［8］。卫生条件的改善和幽门螺杆菌的消除使胃癌发生率降低［9］，但提高进展期和转移性胃癌的生存率仍有较长的路要走［10］，且现有的胃癌生物标志物［11］敏感性和特异性均较低。因此寻找有效的治疗靶点和新的生物标志物至关重要。

研究发现GGT5 在癌相关成纤维细胞中高表达，提示GGT5 可能是肺腺癌［12］合适的治疗靶点。在本研究中，作者发现GGT 水平在GC 患者中较高。生物信息学发现GGT5 在胃癌中高表达，并与不良预后和临床特征相关。作者进一步探索GGT5 在胃癌细胞中的作用机制，通过CCK8、EdU、划痕和Transwell 实验，发现GGT5低表达可以抑制胃癌细胞的生长和迁移，改变胃癌细胞的生物学特性。PI3K/AKT 信号通路可以促进细胞存活，被认为是肿瘤发生和癌症进展的驱动因素，MAPKs也是调节肿瘤发展的重要通路［13］。与对照组相比，敲低GGT5 抑制了AKT、P-AKT、PI3KP85 和P-PI3KP85的表达，降低了磷酸化P38 和ERK 的表达。研究表明，MMPs 作为降解细胞外基质的重要酶，在介导肿瘤血管生成、转移和侵袭中发挥重要作用。WesternBlot 显示，敲低GGT5 后，MMP2、MMP9、EGFR 被抑制。因此，敲低GGT5 可以降低MMPs 的蛋白表达，抑制胃癌细胞的转移。

GO 和KEGG 分析显示GGT5 在调控血管生成、细胞运动和迁移、细胞外基质等相关过程显著富集，表明GGT5 与胃癌的转移和侵袭相关。EMILIN1、HIC1、C1R和TMEM119 与GGT5 呈正相关，与肿瘤的生长和不良预后有关［14-17］，LRPPRC、UCHL5、MAD2L1 和MELK与GGT5 负相关，可能是胃癌新的治疗靶点［18-21］，因此GGT5 可能作为胃癌的预后生物标志物。