四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ毕赤酵母重组质粒构建及其表达

曾 臻，罗家英，蔡依婕，上官雪茹，黄艺虹，李雅婷，李婉褀，谭强来

（厦门医学院，福建 厦门 361023）

自20 世纪人们发现青霉素以来，抗生素便被广泛应用于医疗卫生、养殖生产等行业。然而抗生素滥用的弊端日益显现，抗生素耐药性严重对公共卫生造成严重影响，同时造成环境污染等问题，威胁人们的健康。相较于传统抗生素，抗菌肽是一类在生物体广泛存在的小分子生物活性肽，由先天性免疫防御系统在抵御外来病原微生物侵染时产生，多在12~50 个氨基酸之间[1]。由于抗菌肽种类多、抗菌谱广、不易产生耐药性，对细菌、真菌、病毒、寄生虫乃至癌细胞均可有效抑制或杀伤，应用前景广阔[2]。

鲎抗菌肽是鲎在抵御外源病原体侵袭过程中的天然防御系统之一[3]。目前已发现5 种，其中3 种来源于中国鲎，分别为Tachyplesin I、Tachyplesin II、Tachyplesin Ⅲ，由17 个氨基酸组成；另外2 种来源于美洲鲎，分别为Polyphemusins I、Polyphemusins II，由18 个氨基酸组成[4]。其中，Tachyplesin II 表现出优良的抑菌活性。Xu 等[5]曾选取36 株真菌和细菌用于Tachyplesin II 的抑菌活性测定，结果表明26 株真菌和细菌的生长被有效抑制。然而，天然抗菌肽提取量低，通过基因工程可实现大量制备以应用于实际生产。相较于大肠杆菌，毕赤酵母具有更好的表达后加工修饰能力，有助于保持重组蛋白的生物学活性[6]。因此，本研究拟通过串联表达以期实现高产，为高效制备鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

毕赤酵母X-33 和表达载体pPICZαA（本实验室保存）；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Zeocin 博来霉素（美国英杰生命技术有限公司）；BMGY/BMMY培养基（上海瑞楚生物科技有限公司）；彩虹180 广谱蛋白Marker、Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、YPD 培养基、无氨基酵母氮源（YNB）、生物素和山梨醇（北京索莱宝科技有限公司）；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、PCR 扩增仪、凝胶成像分析仪（美国伯乐）；电转化仪（德国艾本德股份公司）；超净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）；恒温培养箱、恒温振荡器（上海苏坤实业有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）序列的设计

查询抗菌活性及多肽结构数据库（Database of Anti microbial Activity and Structure of Peptides，DBAAS P），获得鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ的氨基酸序列；选用含α-factor 的毕赤酵母蛋白分泌表达载体pPICZαA，以利于高水平的分泌表达。选用X-33 毕赤酵母表达菌，以适于含Zeocin 抗性的pPICZαA 重组质粒的表达。参考Li等[7]的方法，根据胰弹性蛋白酶（-Ala↓或-Gly↓）和羧肽酶A（裂解C 末端氨基酸）的特异性裂解位点，设计四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）序列；根据毕赤酵母密码子的偏好性进行密码子优化；根据4TpⅡ和pPICZαA的碱基序列特点，设计相应酶切位点。

1.3.2 生物信息学分析

参考谭强来等[8]的方法，利用ExPASy 数据库工具包分析4TpⅡ的基本理化性质。

1.3.3 构建重组质粒pPICZαA-4TpⅡ

4TpⅡ序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因合成。然后，用EcoRⅠ和NotⅠ对4TpⅡ和pPICZαA 双酶切，然后T4 DNA 连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞，用Zeocin 抗性LB 平板筛选，并通过酶切和测序验证重组质粒pPICZαA-4TpⅡ是否成功构建，构建策略如图1 所示。

图1 重组质粒pPICZαA-4TpⅡ构建示意图

1.3.4 电转化毕赤酵母X-33 及筛选阳性转化子

参考谭强来等[9]的方法，用SacI 酶切线性化pPIC ZαA-4TpⅡ，电转化毕赤酵母X-33，条件为：0.2 cm 电转杯（预冷）、1 500 V、25 μF 和400 Ω。电击后立即加入1 mol/L 山梨醇（预冷），涂布Zeocin 抗性YPD 平板，30 ℃培养至单菌落长出，以pPICZαA 空载体同上处理作为阴性对照。

1.3.5 重组蛋白4TpⅡ的诱导表达筛选

选取若干个阳性转化子于YPD 中活化，然后转接于BMGY，30 ℃、250 r/min 培养至菌液OD600≈3，离心收集菌体后用含1%甲醇的BMMY 重悬，诱导表达5 d，每隔24 h 补加甲醇至终浓度1%，第5 天离心5 min 收集上清，SDS-PAGE 分析。用含pPICZαA 空载体的酵母转化子同上处理作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）的设计

获取鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ的氨基酸序列（RWC FRVCYRGICYRKCR），设计四联鲎抗菌肽TachyplesinⅡ（4TpⅡ）序列（MARWCFRVCYRGICYRKCRARWCF RVCYRGICYRKCRARWCFRVCYRGICYRKCRARWCF RVCYRGICYRKCRAHHHHHH），中间嵌入胰弹性蛋白酶（-Ala↓或-Gly↓）和羧肽酶A（裂解C 末端氨基酸）的特异性裂解位点。5′端含EcoRⅠ酶切位点和起始密码子ATG（Met，pPICZαA 插入基因所必需），3′端含6×His 标签、终止密码子TAA 和NotⅠ酶切位点。

2.2 4TpⅡ的毕赤酵母密码子偏好性优化

4TpⅡ经毕赤酵母密码子偏好性优化如图2 所示。经优化后的4TpⅡ密码子相对频率雷达图的曲线匹配较好，最优密码子频率增加，GC 含量适宜（39.1%），无重复序列。

图2 4TpⅡ的毕赤酵母密码子偏好性优化

2.3 4TpⅡ的生物信息学分析

4TpⅡ的基本理化参数见表1，预期氨基酸数量为74 个，分子量为9 507.61 Da，等电点为10.23，仅带正电荷，残基总数为24 个，较为稳定，酵母体内半衰期大于20 h，推测适于毕赤酵母表达。4TpⅡ的氨基酸亲疏水性分析如图3 所示，最大值为0.6（第5 位氨基酸），最小值为-2.48（第73 位氨基酸）。

表1 4TpⅡ的基本理化参数分析

2.4 重组质粒pPICZαA-4TpⅡ的验证

对重组质粒pPICZαA-4TpⅡ进行酶切鉴定，结果如图4 所示，表明重组质粒pPICZαA-4TpⅡ构建成功，并经测序验证无碱基和氨基酸突变。

图4 重组质粒pPICZαA-4TpⅡ的鉴定

2.5 重组蛋白4TpⅡ的诱导表达筛选

选取阳性转化子进行重组蛋白4TpⅡ的诱导表达筛选，结果如图5 所示，1 号转化子的泳道清晰，在17~20 kDa 处有一个明显的条带，而阴性对照的泳道则无此条带，表明重组蛋白4TpⅡ表达成功。但电泳测定的分子量比生物信息学预测的结果偏高，与张亚莉等[10]得出的结果相似，推测可能原因，一是4TpⅡ分子量小且带正电荷残基总数多，SDS-PAGE 电泳时迁移变慢；二是生物信息学预测时无法考虑蛋白质翻译后修饰等，导致分子量预测偏小。

图5 重组蛋白4TpⅡ的诱导表达筛选

3 结论与讨论

抗菌肽不仅具有较广泛的微生物杀灭作用，还常存在重要的免疫及非免疫功能，是替代抗生素解决其耐药性的有效方案之一[11]。鲎抗菌肽分子量小、结构简单、不易产生耐药性，在食品医药等领域扮演重要角色。有研究表明，Tachyplesin Ⅰ可拮抗枯草杆菌和隐球菌，还能有效抑制肝癌细胞的生长[12-13]。Tachyplesin II 的细胞毒性较低、抗菌谱广，被广泛应用于医药、食品、畜牧水产业[14]。

直接提取或化学合成抗菌肽成本高、产量低，无法满足实际需要，利用基因工程菌高效制备势在必行，而毕赤酵母操作简单、营养要求低，是高密度发酵和大规模生产的优先选择[15]。王莲哲等[16]利用表达载体pPIC9K和毕赤酵母GS115，成功表达树蛙抗菌肽Cathelicidin。Li 等[7]则利用pGAPZαB 和毕赤酵母GS115，通过串联表达的方式高效制备了Tachyplesin I。

本研究基于毕赤酵母密码子偏好性和生物信息学分析，成功设计4TpⅡ序列，构建重组质粒pPICZαA-4TpⅡ；筛选到1 株重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-4TpⅡ，经30 ℃、250 r/min、1%甲醇诱导5 d 后，分泌表达出重组蛋白，为高效制备鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ奠定基础。后续将优化表达和纯化条件，为基因工程菌生产抗菌肽提供了可资参考的技术途径。