去甲泽拉木醛通过抑制AKT/CREB 信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

韩齐齐，叶梦然，金齐力，2

1蚌埠医科大学检验医学院，安徽 蚌埠 233030；2蚌埠医科大学第二附属医院检验科，安徽 蚌埠233080

肺癌是全球最常诊断的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的一种亚型，占比达80%［1,2］。目前肺癌的治疗方法包括手术切除、辅助靶向治疗、放化疗、联合免疫治疗等，还有一些新兴治疗方法：例如抗体药物偶联物和肿瘤电场疗法等，但其预后仍然不容乐观［3］，由于目前NSCLC治疗方案产生的耐药性和副作用，有效治疗肺癌仍然是一个重要的临床挑战，积极寻找开发新的药物和联合治疗方法非常重要。

近年来，从天然化合物中筛选出安全有效的抗肿瘤成分成为开发新的抗肿瘤药物的趋势，例如，紫杉醇、长春新碱和喜树碱等已被广泛用于预防和治疗癌症，槲皮素、木犀草素、山奈酚等天然化合物具有的抗肿瘤特性也被广泛研究［4］。在中国，天然化合物基于中医疗法已经作为放化疗、手术切除等肿瘤治疗的辅助治疗手段，有很大的治疗前景，NSCLC标准治疗后的中医辅助治疗可缓解症状，提高生活质量［5］，并且相较于其他放化疗药物，中药或其衍生物有更低的毒副作用［6］，有研究表明，天然产物不仅能够增强顺铂治疗效果，而且还能减弱其化疗所导致的毒副作用［7］。去甲泽拉木醛（T-96）是从天然产物雷公藤中提取的去甲木栓烷型三萜类化合物，雷公藤具有广泛药理作用，不仅可以在抗炎、抗病毒等方面发挥作用，还有较强的抗肿瘤作用，在肺癌［8］、结直肠癌［9］、胃癌［10］等多种恶性肿瘤中均有报道，并且相比较于雷公藤二萜类、生物碱类成分，三萜类化合物毒性更低、不良反应少，有很大的治疗潜力［11］。

蛋白激酶B（AKT）的异常激活对肿瘤的生长和进展至关重要，AKT的激活启动磷酸化级联反应，激活下游调控细胞生长、蛋白质合成、抑制细胞凋亡的分子［12］，环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）是AKT的众多下游分子中的一个，可以调控基因的转录，影响多种信号的转导，CREB在造血和实体肿瘤中高表达，主要通过磷酸化CREB残基（Ser133）来发挥其活性，CREB的活化导致控制肿瘤发展的下游基因表达失调，引起异常的信号传导，进而引起肿瘤细胞的无限增殖［13-15］，因此，抑制AKT以及下游分子的活化成为癌症治疗中的有效手段。

尽管有许多研究报道了去甲泽拉木醛的抗癌、抗炎药效，但其能否对肺癌细胞的生长发挥抑制作用，以及是否可以影响AKT的活化尚不清楚。本研究主要以非小细胞肺癌A549 和H1299 细胞为研究对象，体外观察去甲泽拉木醛对于A549和H1299细胞增殖、细胞活力、凋亡和迁移侵袭的作用，并进一步探究可能的作用机制，为非小细胞肺癌的治疗或辅助治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞和药物 非小细胞肺癌细胞株A549和H1299（赛库生物）；去甲泽拉木醛粉末和SC79（MCE）。

1.1.2 试剂和仪器 RPMI 1640 培养基、胎牛血清（Gibco）；青链霉素双抗（100×）、胰酶消化液（含EDTA）、CCK-8试剂、PMSF、RIPA裂解液（Biosharp）；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（联科生物）；二甲基亚砜（DMSO）、特超敏化学发光底物ECL、蛋白上样缓冲液（5×SDS）、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）；兔源性一抗Bcl-2，Bax，β-Actin，cleaved-caspase3，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、AKT 和P-AKT，CREB 和PCREB、连接HRP的二抗（CST）；三色Marker和PAGE快速凝胶配制盒（雅酶）；硝酸纤维素印迹NC 膜（GE Healthcare Life Science）。恒温培养箱、酶标仪Spectrophometer（ThermoFisher）；显微镜，DMI4000B（Leica）；可调温高速离心机（Eppendorf）；流式细胞仪Beckman CytoFLEX flow cytometer（贝克曼）；Tanon-5200成像系统（天能）；垂直凝胶电泳系统（BIO-RAD）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549、H1299细胞所用培养基为含有10%FBS、1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基，置于37 ℃、5%CO2恒定培养箱中培养，在细胞处于对数生长期时进行相关实验。

1.2.2 CCK-8检测细胞活力 收集细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板中，混匀，放入培养箱，待细胞贴壁后，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol/L的完全培养基，继续培养24 h和48 h，更换含10%的CCK-8溶液的完全培养基，培养箱避光孵育1 h，使用酶标仪于450 nm处检测每孔A值，并计算细胞活力，细胞活力（%）=（A加药-A空白）/（A对照-A空白）×100%，实验重复3次。

1.2.3 克隆形成实验检测细胞增殖 收集细胞，制备为1×103/mL的细胞悬液，向6孔板中加入100 μL细胞悬液，配制成含有0、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L去甲泽拉木醛的培养基，培养7～10 d，显微镜下观察克隆细胞团的形成情况。弃去培养基，PBS轻洗，每孔加入4%多聚甲醛中固定30 min，再加入结晶紫溶液染色30 min，染色结束后用流水轻洗孔板，晾干后拍照并计数克隆细胞团数目，实验重复3次。

1.2.4 细胞形态学观察 收集细胞，按2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，待细胞密度达到80%左右，弃去培养基，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、1、3、10、30 μmol/L的完全培养基继续培养48 h，倒置显微镜下观察细胞形态、数量的变化情况，实验重复3次。

1.2.5 划痕愈合实验 收集细胞接种于6孔板中培养，待细胞汇合密度达90%以上，用移液枪枪头沿直尺在培养板底部划十字线，用PBS冲洗表面后，显微镜下观察并拍照记录0 h的划痕面积，之后每孔加入含有0、0.1、0.3、1 μmol/L去甲泽拉木醛的基础培养基，放入培养箱继续培养48 h，在显微镜下观察并拍照记录48 h的划痕面积。用ImageJ计算划痕面积，代入公式计算细胞迁移率，实验重复3次。细胞迁移率=（0 h划痕面积-48h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.6 Transwell 侵袭实验 取24 孔板和Transwell 小室，在小室上层加入100 μL的基础培养基与基质胶混合物（基质胶∶培养基=1∶10），放入培养箱中固定。收集细胞，加入基础培养基，制成细胞悬液，将细胞密度调整至1×105/mL，取100 μL含有0、0.1、0.3、1 μmol/L去甲泽拉木醛的细胞悬液加入到小室上层，在24孔板下室中加入600 μL完全培养基，放入培养箱中培养48 h后，取出小室，用棉棒擦拭上层，放入4%多聚甲醛中固定30 min，用PBS轻洗小室，将小室置于结晶紫溶液中染色30 min，染色结束后，PBS轻洗小室并晾干，显微镜下拍照并计数穿过小室的细胞数目，实验重复3次。

1.2.7 流式细胞术细胞凋亡 收集细胞制成细胞悬液，调整为1×106/mL，混匀后每孔500 μL接种于6孔板中，每孔补加1.5 mL完全培养基，混匀，放入培养箱，待细胞贴壁并增殖到70%～80%，加入含去甲泽拉木醛浓度为0、1、3、10、30 μmol/L的完全培养基继续培养48 h，收集细胞。避光加入Annexin V-FITC和PI染料，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。

1.2.8 Western blotting蛋白印迹分析 药物处理过程同凋亡检测的药物处理，将6孔板置于冰上，加入合适体积的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），待充分裂解细胞刮刀收集，BCA蛋白定量之后加入蛋白上样缓冲液，加热变性。蛋白上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h后4℃过夜孵育一抗，洗膜后加入二抗室温孵育2 h，再次洗膜后显影曝光，实验重复3次。

1.3 统计学分析

研究结果以均数±标准差表示，两组之间比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析，使用GraphPad Prism8.0进行分析，Ρ＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞增殖

CCK-8检测结果显示，随着药物浓度的升高，细胞活力逐渐下降，48 h的药物抑制细胞活力的作用更强（Ρ＜0.05，图1A、B）。克隆形成实验结果显示，与空白组对比，克隆细胞团数量随剂量梯度效应而减少（Ρ＜0.05，图1C～E）。

2.2 去甲泽拉木醛改变非小细胞肺癌细胞形态

在倒置显微镜下观察，相较于对照组，不同药物浓度1、3、10、30 μmol/L处理两株细胞48 h后，细胞形态和数量发生显著变化：随着药物浓度的逐渐升高，细胞由形态饱满变为细长状，由紧密排列状变为细胞间隙增宽，贴壁细胞数目减少、飘浮细胞（死亡细胞）数目增多（图1F）。

2.3 去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌细胞凋亡

流式细胞术分析结果表明，随着药物浓度的增大，凋亡细胞的比例增加，且具有浓度依赖性（Ρ＜0.05，图2A～C）。通过Western blotting检测了相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax和clevaed-caspase3的表达情况，结果显示促凋亡蛋白Bax表达上调，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调，clevaed-caspase3表达上调（Ρ＜0.05，图2D～G）。

图2 去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌细胞发生凋亡Fig.2 T-96 induces apoptosis in NSCLC cells.A-C:Apoptosis of A549 and H1299 cells treated with 1,3,10 and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.D-G: Western blotting for detecting the expressions of cleaved caspase-3,Bax,and Bcl-2 in A549 and H1299 cells treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the relevant proteins levels using Image J.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.4 去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭

划痕实验的结果表明，与空白组相比，去甲泽拉木醛明显延长了两株肺癌细胞划痕愈合的时间，并且呈浓度依赖（Ρ＜0.05，图3A～C）。Transwell 实验进一步表明，去甲泽拉木醛处理后两株肺癌细胞的侵袭能力受到显著抑制，并且呈剂量依赖（Ρ＜0.05，图3D、E）。Western blotting 结果显示，随着药物浓度的增高，Ecadherin的表达上调，N-cadherin、Vimentin的表达下调（Ρ＜0.05，图4F～I）。

图3 去甲泽拉木醛抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭并抑制EMT的发生Fig.3 T-96 inhibits migration and invasion and suppresses EMT of NSCLC cells.A-C: Changes in the scratch area of A549 and H1299 cells treated with 0.1,0.3,and 1 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the cell migration area using Image J. D, E: Transwell assay of A549 and H1299 cells treated with 0.1,0.3,and 1 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the number of cells crossing the chambers(scar bar=100 μm).F-I: Western blotting for detecting the expressions of E-cadherin,N-cadherin,and vimentin in A549 and H1299 cells treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the protein expression levels using Image J.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

图4 去甲泽拉木醛抑制AKT/CREB信号通路的发生Fig.4 T-96 inhibits the AKT/CREB signaling pathway in A549 and H1299 cells.The protein expressions of PAKT/T-AKT and P-CREB/T-CREB were detected using Western blotting and quantitatively analyzed in A549 cells(A,B)and H1299 cells(C,D)treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.5 去甲泽拉木醛抑制AKT 及其下游分子CREB 磷酸化

通过Westernblotting实验检测了0、1、3、10、30μmol/L药物浓度处理A549和H1299细胞48 h后AKT及其下游分子CREB磷酸化水平的表达情况，结果显示P-AKT（Ser473）和P-CREB（Ser133）蛋白表达均下调（Ρ＜0.05，图4A～D）。

2.6 AKT激动剂逆转去甲泽拉木醛诱导非小细胞肺癌凋亡的作用

在A549和H1299两株细胞中，单独使用去甲泽拉木醛组（T-96组）的凋亡率高于对照组（Ρ＜0.05），与上述实验结果一致，而去甲泽拉木醛与SC79的共处理组（T-96+SC79组）凋亡率明显低于单独使用药物组（T-96组）的凋亡率（Ρ＜0.05，图5A～D）。Western blotting结果显示单独使用药物组（T-96组）相比于对照组，Bcl-2表达下调，Bax、clevaed-caspase3表达上调（Ρ＜0.05），与上述实验结果一致，共处理组相较于单独使用药物组（T-96组），Bcl-2 表达上调，Bax、clevaed-caspase3 表达下调（Ρ＜0.05，图5E～H）。

图5 SC79逆转去甲泽拉木醛发挥的促进细胞凋亡作用Fig.5 SC79 reverses the pro-apoptotic effects of demethylzeylasteral.A, B: Western blotting for detecting PAKT/T-AKT expressions in A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79.C,D:Apoptosis of A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79 detected using flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.E-H:Western blotting for detecting the expressions of cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 in A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79. n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs CON group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs T-96 group.

3 讨论

从天然植物中分离出的生物活性物质中开发新药是降低抗癌药物毒性和提高其抗癌有效性的可行途径［16］。从雷公藤中提取的去甲泽拉木醛在结直肠癌［17］、肝癌［18］、胃癌［19］等各种类型的恶性肿瘤中表现出优秀的抗肿瘤活性，但在非小细胞肺癌中的作用少有文献报道。细胞生长和增殖的不受调控是导致肿瘤发生的重要因素，因此我们首先在研究中通过CCK-8和克隆形成实验验证了去甲泽拉木醛能够抑制A549和H1299细胞的活力和增殖，并且通过流式实验也验证了去甲泽拉木醛对A549和H1299细胞具有诱导凋亡的作用，通过Western blotting 实验发现去甲泽拉木醛能够上调Bax和clevaed-caspase3表达，下调Bcl-2表达，以上结果说明去甲泽拉木醛在体外能够对肺癌细胞的生长发挥抑制作用，初步证明了去甲泽拉木醛的在NSCLC中的抗癌作用。

癌症转移是癌症死亡的主要原因，是肿瘤治疗中主要挑战之一，我们通过划痕实验和Transwell侵袭实验验证了去甲泽拉木醛在体外能够抑制A549和H1299细胞的迁移和侵袭作用，并且具有浓度依赖性。研究表明EMT正在成为肿瘤细胞侵袭和转移的关键决定因素，EMT是上皮细胞获得侵入细胞外基质的能力，并转分化成间充质细胞的动态过程［20,21］，在转化过程中，ECadherin等上皮基因的表达或功能丢失，而定义间充质表型的基因如Vimentin，N-cadherin，纤连蛋白的表达增强［22］。所以为了进一步解释去甲泽拉木醛抑制肺癌转移的可能机制，我们通过Western blotting实验检测去甲泽拉木醛对EMT关键分子的表达的影响，结果显示去甲泽拉木醛能够上调E-cadherin 表达，下调Ncadherin和Vimentin表达，可以证明去甲泽拉木醛能够抑制A549和H1299细胞的EMT过程，这可能是去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌转移的机制。

PI3K/AKT通路是癌症中最常被破坏的通路，该通路的激活与实体瘤中细胞增殖、凋亡、血管生成等多种细胞过程有关，为了进一步验证去甲泽拉木醛抑制肺癌细胞增殖和转移是通过影响该通路实现的，我们通过Western blotting检测了药物作用对AKT的磷酸化水平的影响，结果显示，随着去甲泽拉木醛的浓度升高，AKT磷酸化水平被抑制，而总AKT的表达不受影响，说明去甲泽拉木醛抑制了AKT的活化。接着我们使用AKT激动剂SC79进行回复实验发现，SC79部分逆转了去甲泽拉木醛对肺癌细胞发挥的促进凋亡作用，这说明AKT的活化在诱导细胞凋亡过程中发挥了重要作用。靶向肿瘤细胞凋亡途径是种有效的抗癌策略，但是由于健康组织对细胞凋亡也具有一定的敏感性，因此可以选择靶向致癌途径或靶向肿瘤抑制通路诱导凋亡等方式来间接发挥作用，例如靶向AKT信号途径，有研究证明在NSCLC肿瘤组织样本中的AKT阳性率明显高于癌旁组织样本［23］，在NSCLC 基因突变发生率最高的EGFR突变型NSCLC中，AKT的激活可能是在治疗中对EGFR抑制剂产生耐药重要原因［24］，以上均可以说明抑制AKT的激活在抑制NSCLC的发生发展以及肿瘤的治疗中起到关键作用。我们还观察到AKT的下游分子之一CREB的磷酸化水平也被药物抑制，且具有浓度依赖性，CREB调控着上千个下游基因，其中有大量基因的参与肿瘤的发生与进展［25］，所以CREB在肿瘤的发展、维持、进展中起到核心作用，有研究表明［26］，在6种不同类型的NSCLC组织中均检测出CREB的异常激活，我们推测CREB有可能是治疗NSCLC的潜在有效靶点。以上实验结果提示，去甲泽拉木醛可以作为AKT、CREB的抑制剂有望成为抗肿瘤治疗的有前途的候选药物或者与临床抗癌药物联合治疗发挥更好的治疗效果。此外，有文献报道，Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB等多条信号通路来启动和促进EMT［27］。结合以上实验结果我们推测，去甲泽拉木醛抑制非小细胞肺癌细胞增殖，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡，逆转EMT的发生可能是通过抑制AKT/CREB信号传导实现的。

综上所述，去甲泽拉木醛可抑制非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导其凋亡，其作用机制是去甲泽拉木醛抑制了EMT过程和AKT/CREB信号通路，这为寻找非小细胞肺癌治疗的潜在靶点提供了实验依据，也为非小细胞肺癌的治疗提供了新的理论依据。