调节肠道菌群可改善卒中后大鼠的神经功能和抑郁症状

李新翼，刘玉杰，邓克崇，胡义奎

武汉市武昌医院//武汉科技大学附属武昌医院，湖北 武汉430061

脑卒中是常见的临床疾病，卒中后抑郁（PSD）是卒中后最为常见的精神疾病之一，失眠多梦、情绪低落、言语减少、睡眠差等是卒中后抑郁的重要表现，卒中后抑郁不仅严重影响患者的生活质量，还可增加后期卒中复发的风险［1］。目前关于卒中后抑郁的发病机制研究并不十分明确。有研究显示［2-5］，肠道菌群和代谢产物在脑卒中后认知功能中有关键作用，肠道菌群代谢产物可加快认知功能障碍的发生，血清中氧化三甲胺（TMAO）水平与抑郁症正相关；硫化氢（H2S）能够减弱抑郁症状，改善脑卒中损伤。有文献表明［6-8］，TMAO、H2S在脑损伤中的作用机制存在重合，都与PI3K/AKT、NF-κB信号通路等有关。以上这些研究虽然证明了肠道菌群代谢产物TMAO、H2S参与脑卒中、抑郁的发生，但TMAO/H2S在卒中后抑郁中的作用未见报道。本次研究探讨肠道菌群代谢产物TMAO/H2S比值在卒中后抑郁中的作用，为卒中后抑郁患者肠道菌群的干预提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD大鼠购自于华中科技大学动物实验中心，清洁级，7～9 周龄，体质量290～310g，许可证：SCXK（鄂）2021—0009；本实验所涉及的动物实验方案由武汉市武昌医院实验伦理委员会审查并批准。TMAO检测试剂盒、H2S检测试剂盒（上海通蔚实业有限公司）；乳酸杆菌（宁波泰斯拓生物技术有限责任公司）；氟西汀（礼来苏州制药）；利福昔明（重庆赛诺生物药业股份有限公司）；Occludin抗体（Santa Cruz Biotechnology）；caudin-5抗体（affinity）；IgG抗体（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组处理 本次实验分成两部分，第1部分大鼠分为对照组、MCAO组、PSD组，每组15只大鼠；第2部分实验分为对照组、PSD组、粪便移植组、抗生素组、益生菌组、氟西汀组（阳性组），每组9只大鼠。MCAO组为大脑中动脉栓塞模型；PSD组为卒中后抑郁大鼠模型。粪便移植组大鼠处理方法为：收集对照组大鼠粪便，用0.9%的生理盐水混合（200 mg/mL），以2000g离心10 min，收集菌液，用灭菌导管从卒中后抑郁大鼠肛门插入5 cm，注射5mL的菌液，保持大鼠倒立5 min，其余大鼠注入等剂量的生理盐水［9］。益生菌组大鼠处理方法为：卒中后抑郁大鼠每天灌胃乳酸杆菌悬液2 mL（108cfu）［10］。抗生素组大鼠处理方法为：卒中后抑郁大鼠按照150 mg/kg剂量给予利福昔明每天灌胃［11］。氟西汀组大鼠处理方法为：每天给予卒中后抑郁大鼠2.08 mg/kg剂量灌胃［12］。各组大鼠在MCAO术后，每次慢性不可预测轻度应激前，给予上述方法治疗和处理，连续处理28 d。

1.2.2 模型构建［13］MCAO模型构建方法如下：用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，分离颈外动脉、右侧颈总动脉、颈内动脉，将颈外动脉靠近心脏一端结扎，夹闭颈内动脉，在颈总动脉分叉3 mm位置剪开一个小口，插入栓线，进入颈内动脉，松开颈总动脉夹，使栓线进入大脑的中动脉，90 min后，拔出栓线。将颈外动脉结扎。缝合，消毒。术后24 h，给予神经功能评分，筛选评分在1～3分的大鼠。

卒中后抑郁大鼠模型构建：首先按照MCAO模型构建方法处理大鼠，术后24 h，给予神经功能评分，筛选评分在1～3 分的大鼠，继续构建卒中后抑郁大鼠模型。给予慢性不可预测轻度应激（28 d），主要有禁水、禁食24 h，限制行为2 h，夜间照明，潮湿垫料，强迫游泳5 min，倾笼7 h，空瓶暴露，暴露异物，每天在这几种刺激方法中随机选择2种。大鼠在进行神经功能评分、糖水偏好度测试、强迫游泳静止不动时间测试后，采集静脉血，用于ELISA检测。断头取脑，分离缺血脑组织，用于Western blot检测。

1.2.3 神经功能评分［12］测定 采用Longa法进行神经功能评分。0分表示无神经缺损；1分表示肢体瘫痪，前侧爪不能完全舒展；2分表示行走时出现向肢体瘫痪一侧转圈；3分表示行走时出现向肢体瘫痪一侧倾倒；4分表示意识丧失，无法行走。

1.2.4 糖水偏好度检测 在进行实验前3 d，在每个笼子内放置1%的蔗糖水适应饲养。1 d后，放置1瓶1%蔗糖水以及1瓶纯水24 h。在糖水适应以后，禁食禁水24 h。在每个笼子内放100 mL、1%蔗糖水以及100 mL纯水，3 h以后，计算糖水偏好度。糖水偏好度=100%×糖水消耗的体积÷（糖水消耗的体积+纯水消耗的体积）。

1.2.5 强迫游泳静止不动时间 把大鼠放在装有水的容器内5 min，此时大鼠的脚刚好可以碰到容器的底部。记录观察大鼠漂浮在水中不动（头在水面以上，不挣扎，表现为漂浮状态）的时长。

1.2.6 TMAO、H2S水平检测 采用ELISA法检测大鼠血浆中TMAO、H2S含量，步骤参照TMAO、H2S含量检测试剂盒。

1.2.7 Occludin、caudin-5、IgG 蛋白表达检测 采用Western blot方法检测大鼠脑组织中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表达水平。用RIPA裂解液充分裂解脑组织，4 ℃，12 000g离心10 min，取上清，添加上样Buffer，混合煮沸5 min。选用10%的分离胶和5%的浓缩胶，在每个孔内添加40 μg的蛋白样品。80 V电压电泳0.5 h，110V电压电泳2 h。以300 mA恒流转膜1.5 h。PVDF膜放在5%脱脂奶粉中，室温结合2 h。然后将PVDF膜放在一抗内（Occludin、caudin-5、IgG抗体按照1∶500、1∶1000、1∶5000稀释），在4 ℃过夜反应。最后将PVDF膜放在二抗内，室温结合2 h。ECL发光。以β-actin作为参照，分析目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值。

1.2.8 统计学分析 数据均利用SPSS21.0软件统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组数据间比较用t检验，当Ρ＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S与神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间相关性

2.1.1 卒中后抑郁大鼠神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间 与对照组比较，MCAO组、PSD组大鼠神经功能评分升高，强迫游泳静止不动时间增加（Ρ＜0.05）；与对照组比较，PSD组大鼠糖水偏好度降低（Ρ＜0.05）；与MCAO组比较，PSD组大鼠神经功能评分升高，强迫游泳静止不动时间增加，糖水偏好度降低（Ρ＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间比较Tab.3 Comparison of neurological function scores,sugar water preference,and immobility time in forced swimming among different groups of rats(Mean±SD,n=15)

2.1.2 卒中后抑郁大鼠肠道菌群代谢产物TMAO/H2S比值 与对照组比较，MCAO组、PSD组大鼠TMAO水平升高，H2S水平降低，TMAO/H2S比值升高（Ρ＜0.05）；与MCAO组比较，PSD组大鼠TMAO水升高，H2S水平降低，TMAO/H2S比值升高（Ρ＜0.05，表2）。

表2 各组大鼠血浆中TMAO、H2S水平比较Tab.3 Comparison of TMAO and H2S levels in the plasma of the rats(Mean±SD,n=15)

2.1.3 卒中后抑郁大鼠肠道菌群代谢产物TMAO/H2S比值与神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间相关性分析 卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S比值与神经功能评分、强迫游泳静止不动时间正相关（R2=0.3235，Ρ=0.0269；R2=0.6290，Ρ=0.0004），与糖水偏好度负相关（R2=0.4534，Ρ=0.0059）（图1）。

图1 卒中后抑郁大鼠肠道菌群代谢产物TMAO/H2S比值与神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间相关性分析Fig.1 Correlation analysis between TMAO/H2S ratio of gut microbiota metabolites and neurological function score,sugar preference,and forced swimming immobility time in PSD rats. A: TMAO/H2S ratio is positively correlated with neurological function score. B: TMAO/H2S ratio is negatively correlated with sugar preference. C: TMAO/H2S ratio is positively correlated with the forced swimming immobility time.

2.2 粪便移植对卒中后抑郁大鼠的作用

2.2.1 各组大鼠血浆中TMAO、H2S水平变化 与对照组相比，PSD组大鼠TMAO水平、TMAO/H2S比值均升高，H2S水平降低（Ρ＜0.05）；与PSD组比较，粪便移植组、氟西汀组大鼠TMAO水平、TMAO/H2S比值均降低，H2S水平升高（Ρ＜0.05）；与PSD组比较，抗生素组大鼠H2S水平升高，TMAO/H2S比值降低；与PSD组比较，益生菌组TMAO水平、TMAO/H2S比值均降低（Ρ＜0.05，表3）。

表3 各组大鼠血浆中TMAO、H2S水平比较Tab.3 Comparison of TMAO and H2S levels in the plasma of the rats(Mean±SD,n=9)

2.2.2 各组大鼠神经功能评分比较 与对照组相比，PSD组大鼠神经功能评分和强迫游泳静止不动时间均升高，糖水偏好度降低（Ρ＜0.05）；与PSD 组比较，粪便移植组、抗生素组、益生菌组、氟西汀组大鼠神经功能评分和强迫游泳静止不动时间均降低，糖水偏好度升高（Ρ＜0.05，表4）。

表4 各组大鼠神经功能评分、糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间比较Tab.3 Comparison of neurological function scores,glucose preference,and forced swimming immobility time among the groups(Mean±SD,n=9)

2.2.3 各组大鼠脑组织中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表达 与对照组相比，PSD组大鼠IgG蛋白相对表达量升高，Occludin、caudin-5蛋白相对表达量降低（Ρ＜0.05）；与PSD组比较，粪便移植组、抗生素组、益生菌组、氟西汀组大鼠IgG蛋白相对表达量降低，Occludin、caudin-5蛋白相对表达量升高（Ρ＜0.05，图2）。

图2 各组大鼠脑组织中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表达Fig.2 Expression of occludin,caudin-5,and IgG proteins in the brain tissues of the rats in each group.A: Western blots of occludin,caudin-5,and IgG proteins. B: Relative expression level of occludin protein.C:Relative expression level of caudin-5 protein.D:Relative expression level of IgG protein.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs PSD group.

3 讨论

肠道菌群通过影响5-HT等因子的合成和利用进而影响抑郁和认知，抑郁症小鼠的粪便移植到健康正常小鼠后，小鼠可出现抑郁症状［2,14］。而TMAO的产生依赖于肠道菌群，卒中后TMAO增多，TMAO被认为是诱导认知障碍的因素之一［15］。H2S是由肠道内的硫酸还原菌代谢后所产生的，卒中后抑郁患者体内H2S水平下降，H2S改善卒中后抑郁可能与额颞叶梗死密切相关［16］。本研究发现，大脑中动脉栓塞、卒中后抑郁大鼠模型TMAO增多，H2S减少，这与之前的文献相符合，均提示了TMAO、H2S在卒中后抑郁中发挥重要作用。我们还发现，卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S比值与神经功能评分、强迫游泳静止不动时间正相关，且与糖水偏好度负相关。查阅文献［6-8］发现，TMAO、H2S影响卒中、神经功能的机制存在重合，例如，TMAO激活PI3K/AKT、NF-κB 等影响脑血管损伤；H2S 也可通过PI3K/AKT、NF-κB信号途径保护缺血性脑卒中神经损伤。TMAO、H2S在卒中后抑郁模型中水平改变，TMAO/H2S比值与卒中后抑郁有关，这可能与TMAO、H2S作用机制有关。

本研究还发现氟西汀、抗生素、益生菌、粪便移植均改善了卒中后抑郁TMAO/H2S比值。既往文献［17,18］显示，抗生素利福昔明对肠道菌群和炎症有改善作用，而抑郁、血脑屏障等与炎症有关。益生菌乳酸杆菌主要改变了单种菌的丰度和数量，正常大鼠粪便移植能够直接改变大鼠的肠道菌群［19,20］。氟西汀作为5-羟色胺再摄取抑制剂，可通过改善海马组织中5-羟色胺的生物合成、利用度以及再摄取缺陷影响抑郁，氟西汀还可以直接影响肠道菌群的丰富［21,22］。结合上述文献，我们得出结论，氟西汀、抗生素利福昔明、粪便移植可通过影响卒中后抑郁肠道菌群进而改善TMAO/H2S比值，而TMAO/H2S比值又与抑郁症状、神经功能相关，进一步证明了氟西汀、抗生素利福昔明、粪便移植再卒中后抑郁中的作用。

血脑屏障与肠道菌群也存在密切关系，无病原供体粪便微生物群可导致无菌小鼠血脑屏障通透性下降，这与肠道中厌氧细菌产生的短链脂肪酸有关［23,24］。紧密连接蛋白是血脑屏障的关键，Occludin、caudin-5是紧密连接蛋白，因此，Occludin、caudin-5也是维持血脑屏障功能和结构完整的基础［25-27］。IgG是存在于血清中的免疫球蛋白，正常情况下IgG不能透过内皮细胞连接处，当血脑屏障被破坏时，血液中的IgG才能够进入脑组织［28-30］。本研究发现，卒中后抑郁大鼠模型脑组织中Occludin、caudin-5 减少，IgG 增多，而粪便移植、益生菌、抗生素利福昔明均可以不同程度的促进Occludin、caudin-5表达，减少IgG表达，这提示改善肠道菌群能够明显促进卒中后抑郁大鼠血脑屏障的恢复，结合上述文献报道，改善肠道菌群可能通过作用于短链脂肪酸发挥作用。我们还观察到粪便移植、益生菌、抗生素利福昔明这3种不同的处理方法对卒中后抑郁大鼠神经功能、抑郁症状（糖水偏好度、强迫游泳静止不动时间）、TMAO/H2S比值、血脑屏障（Occludin、caudin-5、IgG）的影响程度不同，这可能与使用剂量以及其不同的作用机制有关。

综上所述，本研究证明了肠道菌群代谢产物TMAO/H2S与卒中后抑郁大鼠神经功能、抑郁症状相关，改善肠道菌群能够恢复大鼠血脑屏障，改善神经功能和抑郁，这为肠道菌落干预治疗卒中后抑郁提供了数据支撑。