BZW1 高表达促进胃癌细胞的侵袭和转移：基于调控Wnt//βcatenin通路和促进上皮间质转化

张文静，张 诺，杨 子，张小凤，孙奥飞，王 炼，，宋 雪，耿志军，李 静，，胡建国，

蚌埠医学院第一附属医院1检验科，2胃肠外科，3中心实验室，安徽 蚌埠 233004；4炎症相关性疾病基础与转化研究安徽省重点实验室，安徽 蚌埠233004

胃癌发病率在全球恶性肿瘤中居第5位，死亡率居第4位，造成了极大的社会危害［1,2］。尽管胃癌的治疗技术手段取得了长足进步，但患者术后5年生存率并未得到显著改善，这一定程度上归咎于胃癌细胞的高转移率［3］。上皮间质转化（EMT）是导致胃癌高度侵袭和广泛转移的重要机制［4,5］。碱性亮氨酸拉链蛋白1（BZW1）是bZIP超家族的成员［6］。研究显示，BZW1在胶质瘤中高表达并可通过促进肿瘤细胞的迁移进而影响患者预后［7］。同时，既往研究显示BZW1可通过促进肺腺癌细胞迁移和侵袭加快肿瘤进程，且与患者预后不良有关［8］。此外，BZW1被报道在黏液表皮样癌组织中呈现高表达，而下调BZW1可抑制癌细胞的迁移和侵袭［6］。然而，BZW1在胃癌中的表达情况及其对患者预后的影响和可能的作用机制尚未见报道。本研究联合TCGA等在线公共数据库和本机构临床病例资料明确BZW1在胃癌组织中的表达情况及其对患者预后的影响，采用细胞学实验分析BZW1的作用途径，富集分析联合体外实验验证BZW1可能的作用机制，以期为胃癌临床诊疗靶点的选择及预后评估提供新的参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象和资料

选取2014年1月～2016年12月在我院接受胃癌根治术治疗的患者。纳入标准：确诊为原发性胃癌；临床病理资料完整。排除标准：合并其他组织起源的恶性肿瘤；术前接受过针对胃癌治疗的其他方法；死于胃癌以外的其他原因。本研究共纳入患者共102例，收集患者如下信息：基线资料：从医院电子病例系统采集患者性别、年龄、术前外周血癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）、肿瘤临床分期和手术病理诊断等临床信息；随访资料：术后通过电话随访的方式获取患者术后5年生存情况、死亡时间及原因。手术病理蜡块：从医院病理科调取胃癌患者癌组织和配对癌旁组织蜡块。冰冻组织：从医院生物标本库系统调取20例胃癌患者的癌组织和配对癌旁组织冰冻标本。本研究获得我院伦理委员会的批准（伦科批字[2021]第203号）。

1.2 材料

胃癌细胞株MGC803（国家生物医学实验细胞资源库）；兔抗BZW1多克隆抗体（武汉三鹰）；兔抗Wnt3a多克隆抗体、兔抗β-catenin多克隆抗体、兔抗C-myc多克隆抗体、兔抗N-cadherin多克隆抗体、兔抗Vimentin多克隆抗体、兔抗E-cadherin多克隆抗体、兔抗β-actin多克隆抗体（Abcam）；反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒（Takara）；胎牛血清、RPMI 1640培养基、抗青霉素链霉素双抗混合液、PBS缓冲液、胰酶（GIBCO）；SDS-PAGE凝胶试剂盒（上海酶联生物）；基质胶和Transwell小室（Corning）；特异性过表达和干扰BZW1基因的慢病毒载体及对照空载质粒（上海吉凯基因）；倒置成像显微镜（蔡司）。

1.3 生物信息学分析BZW1表达、与胃癌疾病进展的关系及对预后的影响

本研究通过TIMER 数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）中的TCGA 数据（407 例）分析BZW1 在泛癌中的表达情况；通过UALCAN 数据库（http://ualcan.path.uab.edu）中 的TCGA 数据分析BZW1与胃癌分级（440例）、分期（385例）之间的相关性；采用Kaplan-Meier Plotter 数据库（https://kmplot.com/analysis/）中的GEO数据分析BZW1对患者预后的影响；采用cBioPortal获取胃癌中BZW1的共表达基因，并基于DAVID数据库进行KEGG信号通路富集分析预测BZW1可能的作用机制。

1.4 免疫组化分析BZW1在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况

将手术病理蜡块制成4 μm厚度的切片，60 ℃烤片2 h，依次经脱蜡水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭，孵育一抗BZW1（1∶800，武汉三鹰）及酶标二抗、DAB显色、复染细胞核后进行脱水封片。采集图片，并使用Image-Pro Plus6.0软件分析目标蛋白的相对积分光密度（IOD）值。以胃癌组织中BZW1相对表达量的中位数为界，将胃癌患者分为BZW1高表达组（n=51）和低表达组（n=51）。

1.5 RT-qPCR 检测胃癌组织和癌旁组织中BZW1 的mRNA表达水平

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA后，在QuantStudio DX系统进行实验，并利用2-ΔΔCt法计算BZW1相对mRNA表达量。引物序列由上海生工公司设计合成，序列如下：GAPDH 上游：TGGCCTTCCGTGTTCCTAC，下游：GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA；BZW1上游：5'-ACT GGTGTTCTTCTGGCTAA-3'，下游：5'-GTGCTCATT ACACTTGACCA-3'。

1.6 调控BZW1基因表达对MGC803细胞迁移、侵袭的影响及可能的作用途径和机制

1.6.1 细胞培养、转染和分组 将MGC803细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中（37 ℃，5%CO2）；待细胞密度达70%～80%时，分别将空载体、干扰BZW1载体（si-CAGCGTTTTAAAACTAGAAAAAG）和过表达BZW1载体转染至MGC803细胞中，使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株，并通过Western blot验证转染效果（实验分组：Control，Si-BZW1，LVBZW1）。此外，采用Wnt/β-catenin 通路抑制剂XAV-939（10 μmol/L）［9,10］处理过表达BZW1 基因的胃癌细胞，以进一步分析Wnt/β-catenin信号对胃癌细胞EMT的影响（实验分组：Control，LV-BZW1，XAV-939）。

1.6.2 Transwell 实验分析BZW1 对胃癌细胞迁移和侵袭的影响 将转染成功后的MGC803细胞（5×104）加 入Transwell 上室，下室加入1 mL 含10% FBS 的RPMI 1640培养基，并于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；经4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色后，于显微镜下计数迁移细胞数量。在Transwell上室中预铺基质胶，按照同样的方法进行实验，观察BZW1对胃癌细胞侵袭能力的影响。

1.6.3 Western blot法检测蛋白表达 加入RIPA裂解液裂解并提取MGC803细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，再经过转膜、封闭后，滴加一抗BZW1（1∶500，武汉三鹰）、Wnt3a（1∶1000，abcam）、β-catenin（1∶5000，abcam）、Cmyc（1∶1000，abcam）、N-cadherin（1∶5000，abcam）、Vimentin（1∶1000，abcam）、E-cadherin（1∶10 000，abcam）或β-actin（1∶1000，abcam），并置4 ℃孵育过夜；再经TBST洗膜、孵育酶标二抗、ECL超敏发光液显色及凝胶成像系统采集图片，最后使用ImageJ软件对结果进行定量分析，以β-actin为内参，计算目标蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 26.0 进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验进行两组间比较；采用Spearman检验进行相关性分析；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；Kaplan-Meier（K-M）曲线用于比较患者术后5年生存率的差异；Cox比例风险回归模型分析用于多因素分析；采用受试者工作曲线（ROC）评估BZW1预测胃癌患者术后5年生存率的诊断价值；多组之间比较采用单因素方差分析，两组间比较使用Tukey多重检验法；Ρ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BZW1在胃癌组织中高表达

TCGA数据分析发现，BZW1在包括胃癌在内的多数肿瘤组织中的mRNA表达量均升高（Ρ＜0.05，图1A）。通过本机构收治的病例标本分析显示，BZW1在胃癌组织中的蛋白及mRNA 表达水平均高于癌旁组织（Ρ＜0.05，图1B～D）。

图1 BZW1在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况Fig.1 Expression of BZW1 in gastric cancer tissues and adjacent tissues.A:Expression of BZW1 in various tumor tissues analyzed by Timer 2.0 database. B, C: Protein expression levels of BZW1 in gastric cancer tissues and adjacent tissues detected by immunohistochemistry. D:Expression levels of BZW1 mRNA in gastric cancer tissues and adjacent tissues detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs cancer.

2.2 胃癌组织中BZW1的表达量与外周血肿瘤标志物水平呈正相关

胃癌组织中BZW1 相对表达量与患者外周血中CEA（r=0.623，Ρ＜0.01，图2A）及CA19-9（r=0.552，Ρ＜0.01，图2B）水平均存在正相关关系。

图2 胃癌组织中BZW1的表达量与外周血肿瘤标志物的相关性Fig.2 Correlation between BZW1 expression levels in gastric cancer tissues and the levels of peripheral blood tumor markers CEA(A)and CA19-9(B).

2.3 BZW1的表达水平与多种临床病理参数相关

UALCAN数据库的TCGA数据分析发现，BZW1的表达水平与胃癌患者肿瘤分级（440例）和分期（385例）呈正相关（Ρ＜0.01，图3A、B）。BZW1 高表达组中CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、G3-4期、T3-4期及N2-3期的患者比例高于低表达组（Ρ＜0.01，表1）。

表1 胃癌组织中BZW1表达量与患者临床病理参数间的关系Tab.3 Correlation of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues and clinical pathological parameters of the patients

2.4 BZW1在胃癌中高表达与患者预后不良相关

Kaplan-Meier Plotter数据库中的GEO数据分析显示，BZW1高表达组患者的总生存期较低表达组降低（Ρ＜0.01，图4A）。对本机构病例资料进行K-M生存分析显示，BZW1高表达组患者术后5年生存率低于低表达组（Ρ＜0.01，图4B）。

图4 胃癌组织中BZW1表达量对患者术后5年生存率的影响Fig.4 Impact of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues on 5-year survival rate of the patients.A:Prediction of the long-term prognosis of gastric cancer patients based on BZW1 using the Kaplan-Meier Plotter database.B:K-M survival curve analysis of the impact of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues on 5-year survival rate of patients.

2.5 BZW1高表达是影响胃癌患者根治术后5年生存率的独立危险因素

单因素结合Cox多因素分析显示，BZW1高表达、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3-4期、N2-3期是影响胃癌患者根治术后5年生存率的独立危险因素（Ρ＜0.05，表2）。

表2 影响胃癌根治术后5年生存率的单因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analyses of the factors affecting the 5-year survival rate after radical surgery for gastric cancer

2.6 BZW1对胃癌患者术后5年生存率的评估价值

ROC分析显示，以BZW1相对表达量3.61为截点值，BZW1 预测胃癌患者术后5 年死亡的敏感性为75.56%，特异性为71.93%，曲线下面积为0.732（Ρ＜0.01，图5）。

图5 BZW1对胃癌患者预后的评估价值Fig.5 Assessment of the prognostic value of BZW1 for gastric cancer patients.

2.7 BZW1促进胃癌细胞的迁移和侵袭

采用慢病毒转染的方式分别构建下调和上调BZW1基因的胃癌细胞系（MGC803），Western blot结果显示慢病毒转染成功（Ρ＜0.05，图6A、B）。Transwell实验结果显示，下调BZW1可抑制MGC803细胞的迁移和侵袭，而上调则相反（Ρ＜0.05，图6C～E)。

图6 BZW1促进胃癌细胞的迁移与侵袭Fig.6 BZW1 overexpression promotes gastric cancer cell migration and invasion.A:Validation of BZW1 protein expression after lentivirus transfection using Western blotting. B: Quantitative analysis of the relative expression levels of BZW1 protein. C:Transwell experiment for analyzing the impact of BZW1 on the migration and invasion abilities of gastric cancer cells. D:Quantitative analysis of the number of migrated cells.E:Quantitative analysis of the number of invaded cells.*P＜0.05 vs Control.

2.8 BZW1促进胃癌细胞的EMT进程

Western blot检测结果显示，上调BZW1可促进胃癌细胞中N-cadherin与Vimentin的表达，同时抑制Ecadherin 的表达，而下调BZW1 则呈现相反的结果（Ρ＜0.05，图7A、B）。

图7 BZW1促进胃癌细胞EMT进程Fig.7 BZW1 overexpression promotes EMT of gastric cancer cells.A:Detection of expression levels of the key protein markers of EMT using Western blotting.B:Quantitative analysis of the relative expression levels of the protein markers.*P＜0.05 vs Control.

2.9 BZW1通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与促进EMT进程

KEGG通路富集分析显示，BZW1的功能可能与Wnt信号有关（图8A）。Western blot实验结果证实，下调BZW1 可抑制Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白Wnt3a、β-Catenin、C-myc的表达，上调则反之（Ρ＜0.05，图8B、C）。此外，使用Wnt/β-catenin 通路抑制剂XAV-939可削弱BZW1对EMT关键蛋白（N-cadherin、Vimentin及E-cadherin）的激活作用（Ρ＜0.05，图8D、E）。

图8 BZW1激活Wnt/β-catenin信号通路促进EMT进程Fig.8 BZW1 overexpression activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote EMT of gastric cancer cells.A:KEGG enrichment analysis of co-expressed genes with BZW1. B: Detection of expression levels of the key protein markers of the Wnt/β-catenin signaling pathway using Western blotting. C: Quantitative analysis of the expression levels of the key protein markers of the Wnt/β-catenin signaling pathway.D:Detection of protein expression of the key EMT markers using Western blotting.E:Quantitative analysis of protein expression levels of the key EMT markers.*P＜0.05 vs Control.

3 讨论

本研究明确了BZW1在胃癌组织中表达水平，并进一步分析了其与患者远期预后的关系及可能的作用机制。本研究发现BZW1在胃癌组织中表达升高，并影响胃癌恶性进展和患者术后5年生存率；BZW1对胃癌细胞迁移、侵袭及EMT 进程的促进作用可能与激活Wnt/β-catenin信号有关。

虽然既往并无BZW1参与胃癌进展的报道，但有研究表明，BZW1在前列腺癌、胰腺导管癌等肿瘤组织中表达升高，并参与了肿瘤细胞的恶性进展［11,12］，而本研究结合生物信息学和临床病例分析发现，BZW1在胃癌组织中高表达并影响患者预后。本研究利用癌症公共数据库证实BZW1在包括胃癌在内的多种肿瘤组织中高表达，且通过本机构纳入的胃癌患者病理标本分析进一步证实，BZW1在胃癌组织中的蛋白和mRNA水平均显著增加，提示BZW1在胃癌发生或发展中可能发挥某种作用。外周血CEA和CA19-9在胃肠道肿瘤诊断、病情评估及预后判断中的重要价值受到高度认可，是当前应用较为广泛的肿瘤标志物［13,14］。然而，本研究发现胃癌组织中BZW1 的表达量与患者外周血CEA 和CA19-9水平呈显著正相关，也与胃癌病理G分级和浸润程度等临床病理参数密切相关，提示BZW1参与了胃癌的恶性进展。为进一步探究BZW1在胃癌诊疗中的潜在价值，我们通过Kaplan-Meier Plotter数据库及对本机构纳入的临床病例资料进行分析，发现。BZW1在胃癌组织中高表达与患者预后不良相关。更为重要的是，单因素结合Cox多因素分析提示BZW1高表达是影响胃癌患者术后5年生存率的独立危险因子。此外，ROC分析显示BZW1对胃癌患者术后5年生存率具有较高的判断价值。以上结果说明BZW1在胃癌组织中高表达与疾病恶性进展和患者预后密切相关，但其具体作用途径有待进一步研究。

肿瘤细胞的迁移和侵袭是影响胃癌疾病进展和患者预后的关键因素［15,16］。为探究BZW1影响胃癌患者远期预后的功能学途径，我们采用慢病毒转染的方式分别上调和下调胃癌细胞中BZW1的表达水平，并通过Transwell实验发现下调BZW1可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，上调则反之。EMT是肿瘤细胞发生转移重要的途径之一［17,18］，且既往有多项研究表明调控肿瘤细胞的EMT进程可抑制胃癌细胞的恶性行为，如FBL1M1可促进胃癌细胞EMT过程从而参与胃癌恶性行为的调控［19］，以及敲减CPNE7可通过影响EMT进程抑制胃癌细胞增殖、迁移与侵袭［20］。而该过程伴随着上皮细胞表面标志物E-cadherin表达降低和间质细胞表面标志物N-cadherin和Vimentin表达升高［21,22］。本研究发现，上调BZW1可促进胃癌细胞EMT进程，而下调BZW1则抑制其进程。以上结果证明BZW1可能通过促进胃癌细胞EMT进程参与其恶性行为，从而部分解释了我们临床研究中发现的BZW1促进胃癌疾病进展及与患者预后不良的关系；同时，也拓展了胃癌EMT生物过程新的调控因子。

最后，本研究尝试探讨BZW1调控胃癌细胞EMT进程的分子机制。首先，通过生物信息学富集分析我们发现BZW1在胃癌中的作用可能与Wnt信号有关。既往研究表明Wnt/β-catenin信号是调控细胞EMT进程的重要通路［24,25］，下调其关键通路蛋白Wnt3a、β-catenin、C-myc的表达可抑制肿瘤细胞的EMT进程［5,25-27］。通过细胞学实验我们发现，下调BZW1 可抑制Wnt3a、βcatenin、C-myc蛋白的表达，上调则反之；而使用Wnt/βcatenin信号抑制剂XAV-939可部分消除上调BZW1对胃癌细胞EMT 的促进作用。XAV-939 是一种靶向Wnt/β-catenin信号通路特异性的小分子抑制剂，可通过抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶使Axin 蛋白稳定，抑制β-catenin介导的转录从而阻断Wnt/β-catenin信号通路［28］。这些结果表明BZW1对胃癌细胞EMT进程的促进作用，可能与激活Wnt/β-catenin信号有关。这一研究结果不仅拓展了对BZW1生物学功能的认识，还有望为胃癌的临床诊疗提供新的靶标。

本研究尚存在以下不足：由于纳入临床病例样本量较少，本研究所得结果仍需进一步扩大样本量进行验证；尽管本研究证实BZW1可能通过激活Wnt/β-catenin信号促进胃癌EMT进程，但仍不能排除其通过其他途径参与胃癌疾病进展的可能。

综上所述，BZW1在胃癌组织中表达升高影响胃癌恶性进展和患者预后，可能与激活Wnt/β-catenin信号促进胃癌细胞EMT进程有关。