一种基于Filter Faster R-CNN的数字PCR液滴检测技术

张一鹏，陈 波，李家奇，梁业东，张华剑，吴文明，张 煜

1南方医科大学生物医学工程学院，2广东省医学图像处理重点研究室，3广东省医学成像与诊断技术工程实验室，广东 广州 520515；4广东省科学院生物与医学工程研究所，广东 广州 510316；5五邑大学应用物理与材料学院，广东 江门 529000；6五邑大学生物科技与大健康学院，广东 江门529020

作为第3代PCR技术，数字PCR（dPCR）［1］具有高灵敏度、高准确性和可重复性的优点［2］，被广泛应用于癌症早筛［3］、无创产前检测［4］、病毒检测［5］、转基因分析［6］等领域，具有广泛的应用价值。根据样本分散的方式，dPCR主要分为芯片式dPCR（cdPCR）［7］和液滴式dPCR（ddPCR）［8］。与cdPCR相比，ddPCR无需设计密集的微孔阵列，降低了微流控芯片的设计要求和成本，具有更高的灵活性。不同于cdPCR能够直接获取芯片上所有微室的总数、相对位置和体积，ddPCR实验中液滴的数量、位置和体积均是随机的，且实验过程中更容易受灰尘影响，对阴性和阳性液滴位置和体积的预测提出了更高的要求。

ddPCR 检测过程包括定位和分类两个方面。ddPCR图片通常包含数千至数万个微滴，仅使用人工定位、分类并计数是非常困难且耗时的。目前已经有许多基于经典机器视觉的自动分析算法被应用于分析ddPCR图片，例如，霍夫圆变换［9,10］、局部阈值分割［11］、分水岭算法［12,13］、HOG特征分类［14］、基于形态学算法识别微流控芯片液滴［15］、基于大津分割的局部分割算法［16］等。尽管这些算法能够自动分析ddPCR图片，不同程度的提高了微滴识别的效率和准确性，但只能处理少量稀疏的液滴，而且容易将灰尘、芯片表面的划痕以及微小凹陷形成的异常斑点错误地识别为液滴。

深度学习方法能够自动学习图片中的特征，实现更高的准确率，已开始应用于dPCR检测中。Song等［17］基于DeepLabv3+网络将类别标签分配给dPCR图像中的每个像素后，使用霍夫圆变换统计液滴的个数，实现了对失焦的dPCR图像中形状不规则液滴的预测。Yang等［18］使用霍夫圆变换检测液滴位置，通过卷积神经网络区分无效、阴性和阳性微滴。然而，由于霍夫圆变换无法同时检测多尺度的液滴，导致模型在计数和预测时容易漏检液滴融合形成的大液滴或液滴破裂产生的小液滴，增加了ddPCR实验过程中的检测误差。为了避免霍夫圆变换的缺陷，Zhang等［19］提出了一种基于改进YOLOv3的少镜头学习算法，实现了光照不均匀和存在灰尘的情况下的液滴检测，但只能同时处理微流控芯片中固定位置的少量液滴。为了提升dPCR检测通量，Hu等［20］和孙刘杰等［21］使用Mask R-CNN实现了密集阵列微流控芯片中阳性液滴的预测，但在这两种方法中，只考虑了阳性液滴的预测，阴性液滴的统计仍依赖于数字微流控芯片，均不能应用于ddPCR 图像中液滴的预测。Lee等［22］不再使用微流控芯片，利用Mask R-CNN检测ddPCR图像中所有液滴，并用高斯混合模型对网络预测结果进一步分类，降低了阴性液滴和阳性液滴的误检率，但网络的准确率只有93.84%。由于ddPCR图像中的液滴数目和位置均不固定，目前已有的dPCR检测模型多用于cdPCR中，且不能兼顾高通量、高准确率和抗灰尘干扰这些优点，这将为dPCR的绝对定量引入较大的偏差。

在本研究中，我们设计了一种包含3个过滤分支的异常点过滤模块，并将其与Faster R-CNN相结合，称之为Filter Faster R-CNN，以检测荧光微滴。利用异常点与阳性液滴之间的差异，剔除由Faster R-CNN预测的阳性液滴中误检的异常点，从而实现高通量、稳定和准确的ddPCR检测。实验结果表明，在少尘和多尘的环境中，Filter Faster R-CNN 的召回率分别为99.10%和99.13%，准确率分别为99.20%和99.15%，阳性液滴准确率分别达到了98.23%和88.35%，F1 分数分别为99.15%和99.14%，高于其他网络模型。使用Filter Faster R-CNN对4组不同浓度样本进行绝对定量实验，将其结果与商业化流式检测设备的结果进行比较，得到的回归线斜率为1.0005，截距为-0.025，决定系数达到0.99969，表明两者结果高度一致。

1 材料和方法

1.1 实验环境

本文中用来采集图片的荧光显微镜为基恩士（中国）有限公司的BZ-X800E，测量试剂浓度的流式ddPCR设备是新羿制造科技（北京）有限公司的数字PCR平台TD-2。本文实验在Linux操作系统中进行，使用了显存为11G的NVIDIA GeForce RTX 2080Ti显卡，编程语言为Python3.6，基于PyTorch深度学习框架。

1.2 ddPCR实验

1.2.1 试剂准备利用Primer Express（Applied Biosystems）软件，从GenBank（NC_039476.1）序列的基因保守序列中设计含有诺如病毒片段的质粒、引物和探针（生工生物）。其中正向引物序列为5'-CTGTGCT CATCAAACGCCC-3'，反向引物序列为5'-CAACATA CCCATCTGTCCGC-3'，探针序列为5'-FAM-ACCGG AGAGCTCATGCCTCTTGCAG-BHQ1-3'。本文实验使用20 μL的ddPCR反应体系中包含：0.9 μL模板质粒，0.5 μL 探针（10 μmol），1.8 μL 正、反引物（10 μmol），10 μL 预混合液（BIO-RAD，ddPCR Supermix for Probes No dUTP）。使用液滴生成仪（广州永诺生物科技有限公司，MicroDrop-20A）将20 μL的反应体系在微滴生成油（BIO-RAD，Droplet Generation Oil for Probes）中生成含微滴的50 μL样本，随后会被收集到PCR 管送入基因扩增仪（BIO-GENER,RePure）进行PCR扩增。扩增后，阳性微滴和阴性微滴在样本试剂中随机均分分布。

1.2.2 图像采集 将获得的样本试剂均匀滴在带有凹槽的玻璃载玻片或聚碳酸酯（PC）片上。这些载玻片的凹槽尺寸为15 mm×15 mm×0.1 mm。实验中，考虑了少尘和多尘两种环境条件。使用荧光显微镜采集微滴在FAM通道的荧光图像，这些图片的尺寸为640×480像素，每个像素的边长为5.66 μm/pixel。通过上述实验方法，我们收集了140张ddPCR图片。这些图片中，有55张含有不同程度的异常斑点。为了进行后续分析，数据集被随机划分为104张训练集和36张验证集。

1.3 图像标注与预处理

采用霍夫圆变换对微滴的位置进行预标注，同时收集预标注圆内的平均灰度信息，利用高斯混合模型，基于这些灰度值，进行了二分类，以区分阳性和阴性微滴。对于位置独立圆形目标，霍夫圆变换能够准确的获得其圆心和半径，然而，当液滴存在边缘模糊或挤压等情况时，可能会出现漏标和错标的情况。本研究进一步使用Labelme［23］标注工具，对一些错误分类和遗漏液滴进行矫正，并添加异常斑点的标签（图1A～D）。通过上述标注方式，将标注时间平均缩短到了5 min，显著降低了标注工作的工作量。

图1 ddPCR图像预处理Fig.1 ddPCR image preprocessing(Scale bar=300 μm).A:Original ddPCR image.B:Local portion of the ddPCR image.C: Pre-annotation using Hough Circle Transform,with yellow arrows indicating missed and mislabeled areas. D:Manual label correction and addition of anomaly point labels.E:Image with Gaussian blur.

对数据集中的ddPCR图片进行有重叠的随机采样，采样图片大小为160×160，之后将尺寸统一调整为800×800像素。以液滴圆心位置为依据，抛弃位于图片外的微滴标签。本研究对每张图像都使用了5、9、13、17、21中的随机一种高斯卷积核进行卷积处理，得到了每张图像对应的模糊图像（图1E）。在去除无液滴图像后，本研究最终得到2462张训练集图片和672张验证集图片。

1.4 Filter Faster R-CNN框架

Filter Faster R-CNN的模型框架由Faster R-CNN和异常点过滤模块两个部分组成（图2）。ddPCR图片经过Faster R-CNN 后，会输出初步预测的液滴预测框。然后，保留阴性液滴预测框信息，仅将阳性液滴预测框输入异常点过滤模中，去除其中不属于阳性液滴的异常点，最终输出所有液滴预测框的坐标和分类标签作为检测结果。

图2 Filter Faster R-CNN模型框架，其中橙色虚线为Faster R-CNN部分，蓝色虚线为异常点过滤模块Fig.2 Filter Faster R-CNN model framework,in which the orange dotted line is the Faster R-CNN and the blue dotted line is the Filter module.

1.4.1 Faster R-CNN模块 Faster R-CNN负责ddPCR图片中的微滴的初步识别，包含backbone、RPN、RoI Align和分类器。本研究将ResNet50与FPN［24］结合作为Faster R-CNN的backbone，并为FPN中的特征图分配了单一尺度的锚框，分别为{16、32、64、128、256}，锚框比例设置为{1∶2、1∶1、2∶1}，这些预选锚框能够涵盖数据集中所有液滴的尺寸。ddPCR图片经过Faster RCNN后产生初步预测的类别和微滴位置预测框。

1.4.2 异常点过滤模块 在ddPCR图片中，由于各种原因，如灰尘附着、气泡、液滴破裂、表面划痕、凹陷等，常会出现异常光斑（图3）。这些异常斑点在荧光显微镜下呈现出与阳性微滴相近的荧光强度，它们的位置是随机的，且形状各异。在进行微滴预测时，神经网络常常会误将这些异常点识别为阳性微滴，这可能导致计算得到的样本浓度偏高，特别是在低浓度试剂检测时，其影响尤为显著。降低这些异常点的影响可以进一步提高对试剂检测的准确性。

图3 常见异常斑点Fig.3 Representative anomalous spots (Scale bar=300 μm). A: Fuzziness or scratches. B: Bubbles within droplets. C: Dust particles between droplets.D:Dust outside the grooves.

由于异常点与阳性微滴在形态上具有差异，这使我们能够通过阳性液滴预测框内的信息，判断这些预测框内的液滴是否为异常点。基于Faster R-CNN模型输出的微滴位置预测框和类别信息，本研究提出了一种去除异常点的过滤网络。该网络的主要作用是删除包含灰尘且不属于阳性微滴的预测框。该网络有3个并联的分支组成：哈希过滤分支、分类过滤分支和相减过滤分支，过滤模块结构如图2中Filter部分所示。最终，3条支路的投票结果被作为异常点过滤模块的最终输出。

1.4.2.1 哈希过滤分支 把所有微滴预测框缩放至边长为平均直径的正方形，再将它们相加取平均，得到平均微滴图像。对所有阳性微滴图片和平均微滴图片进行均值二值化处理，将大于均值的像素点标记为1，反之标记为0。接下来，将阳性液滴预测框调整至与平均微滴图像相同，用于获取预测框的哈希值。与计算平均微滴图像时的方法不同，对于尺寸与平均直径Rˉ不同的微滴，在调整过程中，先将长边调整至平均直径，接着对短边Ri等比例缩放，使用0来填充剩余的区域。通过将二值化的预测框和平均微滴图像取异或，得到了每个阳性微滴的哈希值，公式如下：

其中Ai为二值化的阳性液滴预测框，Aaverage为二值化的平均微滴图像。考虑到异常点的直径通常小于正常微滴、图像拉伸会引起一定程度的失真等因素，在计算哈希值时，本研究引入一个参数K，满足公式（2），本文中我们将参数K中的p值设定为1.5：

若哈希值为T，代表预测框与平均微滴有T%不相同，本文中阈值T设定为22，超过阈值的预测框将被作为异常点。

1.4.2.2 分类过滤分支 基于异常点与正常微滴形态上的直观差异，我们将输入的预测框通过映射的方式实现微滴分类。在这个分支中，我们使用两个全连接层来构建模型。预测框图像通过展平层转换为一维向量，第一个全连接层将输入图像的一维向量映射到一个隐藏层，这个隐藏层可以提取图像的特征表示。第二个全连接层将隐藏层的输出映射到最终类别，即预测框是否为异常点。

1.4.2.3 相减过滤分支 考虑到试剂类型、光照条件、芯片材质、曝光时间等外界环境的影响，不同图片中微滴图像也存在不同，本文还设计了一个相减过滤分支，这个分支是利用同一张ddPCR图内预测框与平均微滴的相似程度进行异常点的划分。相似程度具体表现为预测框与平均微滴像素值之差的绝对值，这个绝对值矩阵将被作为分支的输入，通过对相似度分类实现对异常点的检测。相减过滤分支后续网络结构与分类过滤分支均相同。

在异常点过滤模型中，将阳性液滴标记为1，异常点则标记为0。本文采用了二分类交叉熵损失函数，用于比较模型的分类预测与实际标签，从而计算损失。

1.5 实验设置

为了训练Filter Fast R-CNN，本研究首先训练其中Faster R-CNN部分。本文将batch size设置为8，并使用SGD优化器，将初始学习率设置为0.01，每3轮衰减一次，衰减倍率为1/3。训练150个epoch后，冻结Faster R-CNN部分权重，利用网络对ddPCR图片进行预测可以得到包含误检异常点的液滴预测框、标签以及置信度。去除低置信度（＜0.5）的预测框后，将其中阳性液滴预测框作为输入开启异常点过滤模块的训练。在异常点过滤模块中，使用了Adam优化器，初始学习率设置为0.001，β1=0.9，β2=0.999，共训练500个epoch。

训练结束后，利用最终的权重对ddPCR图片进行预测可以获得阴性液滴和阳性液滴的预测框。为了评估模型的性能，本文通过比较预测框与真实标签计算召回率、精确率和F1分数评估网络对液滴的预测性能，更进一步，Filter Faster R-CNN还会被用于ddPCR绝对定量实验，通过与流式检测设备的结果比较，验证模型对样本试剂的检测性能。

1.5.1 评估指标 本文使用召回率、精确率和F1分数评价模型对ddPCR图片中液滴的预测性能，对应的公式如下：

其中，TP代表正确预测的微滴数，即ddPCR图片中与液滴真实框IoU大于0.5，且标签相同的预测框个数；FP代表误检的微滴个数，包含与所有液滴真实框IoU均小于0.5的预测框和错误分类的预测框；FN代表模型漏检的微滴数。此外，在本文中还使用了一种准确率的修改式，不考虑TN项，仅对阳性液滴的检测性能进行评估，称为阳性准确率。阳性准确率反映了模型对阳性液滴的检测性能，阳性准确率越高，核酸片段数量的统计就更精确，更有利于低浓度的样本的检测，其公式如下：

1.5.2 统计学方法 本文使用独立样本t检验来进一步评估过滤模块在不同环境中分别对SSD 和Faster RCNN检测性能的影响，比较原网络和添加过滤模块后网络的预测性能，若Ρ＜0.05，则认为二者的均值差异具有统计学意义。

1.5.3 ddPCR绝对定量 为了评估模型对样本试剂的检测性能，模型将用于检测4组不同浓度的ddPCR实验图片，利用输出预测框中的信息，我们可以得到所有阴性液滴和阳性液滴的像素级直径，从而进行ddPCR的绝对定量实验。

ddPCR产生微小液滴中含有的目标核酸片段数量符合泊松分布，只需要统计阴性液滴和阳性液滴的数量就可以计算待测样本中核酸片段浓度。泊松分布的概率函数为：

采集到的ddPCR图像中，包含N个微滴，各微滴的半径对应的像素为ri，图片中每个像素对应的真实长度为k，则微滴的平均体积为：

当k=0时，P(0)代表不含有核酸片段的阴性微滴在总液滴数的占比，根据泊松分布，单个微滴中含有核酸片段的期望λ：

最终样本试剂的浓度可以通过单个微滴中含有核酸片段的期望除以液滴的平均体积得到：

2 结果

2.1 算法收敛性分析

图4 展示了650 个epochs 中训练Filter Faster RCNN在验证集上的Loss函数曲线。前150个epochs为训练Faster R-CNN部分，迭代25个epochs后趋近于收敛。从151 个epoch 开始，冻结Faster R-CNN 部分权重，仅训练Filter模块，重新迭代250个epochs后模型重新收敛。相比第一次收敛，模型总损失下降了0.003。

图4 Loss函数收敛性能分析Fig.4 Convergence performance analysis of Loss function.

2.2 异常点过滤模块消融实验

本文选择Faster R-CNN作为基线，保持所有实验数据和参数设置不变，将Faster R-CNN分别与分类过滤分支、相减过滤分支、哈希过滤分支以及整个异常点过滤模块结合后，对验证集中的ddPCR 图片进行预测。相比作为基准的Faster R-CNN，添加过滤分支后不会导致模型预测的召回率的降低，且能不同程度的提升模型预测的精确率、阳性液滴准确率和F1参数。仅添加单个过滤分支时，相减过滤分支性能优于其他两类过滤分支。此外，异常点过滤模块通过综合3条分支的预测结果，实现除召回率外其他各项指标均达到最佳。相比Faster R-CNN，本文提出的Filter Faster R-CNN的精确率提升了0.25%，阳性液滴准确率提升了1.16%，F1分数提升了0.13%（表1）。

表1 验证集中以Faster R-CNN为基准模型的消融实验对比Tab.3 Comparison of ablation experiments using Faster R-CNN as the benchmark model in the validation set

2.3 与其他检测算法比较

将Filter Faster R-CNN与其他ddPCR检测算法在少尘和多尘的条件下比较，这些作为对比的方法包含霍夫圆变换与全局阈值二分类、Yang等［18］提出的霍夫圆变换与卷积神经网络（CNN）结合（以下称作Hough-CNN）、目标检测网络SSD、Faster R-CNN以及SSD与本文提出的过滤模块相结合的Filter SSD（表2）。与真实标签的IOU值大于0.5的预测框作为正确预测，本研究分别计算了在不同环境中各算法的召回率、精确率、阳性准确率和综合F1分数，网络在少尘和多尘环境中部分预测结果（图5、6）。

表2 模型在少尘和多尘环境中性能对比Tab.3 Performance comparison of the model in low-dust and dusty environments

图5 少尘环境中ddPCR图像测试结果Fig.5 Test results of ddPCR images in a low-dust environment,where red boxes represent positive droplets,blue boxes represent negative droplets,and yellow boxes represent anomaly points (A and B are both representative cases).

图6 多尘环境中ddPCR图像测试结果Fig.6 Test results of ddPCR images in a dusty environment,where red boxes represent positive droplets,blue boxes represent negative droplets,and yellow boxes represent anomaly points.A and B are both representative cases.

在灰尘较少的环境中，霍夫圆变换的阳性准确率为88.16%，Hough-CNN去除了灰尘的影响，将阳性准确率提升至97.16%。使用传统目标检测网络时，相比SSD，Faster R-CNN的准确率更高，与异常点过滤模块相结合后，Filter Faster R-CNN能够获得最佳预测性能，其召回率为99.10%，精确率为99.20%，阳性液滴准确率为98.23%，综合F1分数为99.15%。

在灰尘较多的环境中，霍夫圆变换的阳性液滴准确率下降了8.85%。Hough-CNN 依赖于霍夫圆检测结果，在多尘环境中的分类性能与全局阈值分类相近，其阳性准确率为79.09%。SSD和Faster 的阳性准确率相比少尘环境大幅下降，但与过滤模块结合后，Filter SSD和Filter Faster R-CNN 的阳性准确率分别提升至80.91%和88.35%。综合来看，Filter Faster R-CNN在多尘环境中取得了最佳检测性能，通过牺牲少量召回率，将准确率、阳性微滴准确率和F1参数提升至99.15%，88.35%和99.14%。

通过T 检验评估过滤模块在不同环境中分别对SSD和Faster R-CNN检测性能的影响的结果如表3所示。在少尘环境中，添加异常点过滤模块后网络与原网络的检测性能没有明显差异（Ρ＞0.05）。在多尘环境中，过滤模块能显著提升网络的阳性准确率。特别的，对于Filter Faster R-CNN相比原网络的精确率有显著提升（Ρ=0.044）。

表3 添加Filter模块后的T检验的ΡTab.3 P values of t-tests after adding the Filter module

2.4 ddPCR验证

本研究分别运用SSD、Filter SSD、Faster R-CNN和Filter Faster R-CNN，对测试集中的4组不同浓度的完整ddPCR图像进行检测。4组ddPCR图像都绘制了相应的箱型图，并根据预测浓度的均值绘制了回归曲线，图中横坐标为商业化设备的检测结果。相比未添加过滤模块的网络模型，Filter SSD和Filter Faster R-CNN预测结果的各浓度间具有良好的线性关系，R2分别为0.99904和0.99969，与试剂的标准浓度具有良好的一致性，回归线斜率分别为0.992和1.005。Filter Faster RCNN的检测结果中没有离群值，能够很好地抑制异常斑点带来的影响（图7）。

图7 SSD与Faster R-CNN添加Filter模块前后预测结果比较Fig.7 Comparison of prediction results before and after adding the Filter module for SSD and Faster R-CNN.

3 讨论

在ddPCR实验中，样本被分割成多个液滴，形成独立的反应单元。在扩增完成后，通过统计阴性和阳性液滴，可以对目标核酸进行绝对定量［27］。然而，ddPCR图像中可能出现的异常点，如灰尘和划痕等因素，极大地影响了阳性微滴识别的准确性。尤其是在检测低浓度试剂时，异常点的误检可能导致检测结果明显偏高，超过真实样本浓度。目前常用的液滴检测算法存在一些问题，包括只能处理稀疏且无尘的液滴图片［9-16］、不能同时识别多尺度液滴［18,28］、仅适用于基于芯片的液滴图像［17,19-21］、准确率不高［22］等。为了解决这些问题，本研究提出了Filter Faster R-CNN。针对ddPCR图像中的异常点，通过引入Filter模块，成功减少了异常点对结果的影响。为了应对多尺度液滴，本研究设置了5个尺度的锚框，涵盖了所有液滴融合或破裂后的尺寸。此外，该方法能够对密集的液滴图像进行精确检测，避免了对芯片液滴图像的依赖。

Filter Faster R-CNN的消融实验结果显示，相比作为基准的Faster R-CNN［26］，添加过滤分支后不会导致模型预测的召回率的降低，且能不同程度的提升模型预测的精确率、阳性液滴准确率和F1参数。仅添加单个过滤分支时，相减过滤分支性能优于其他两类过滤分支。此外，异常点过滤模块通过综合三条分支的预测结果，实现了最佳预测性能。

与其他ddPCR检测算法［18,25,26］的比较结果显示，相比使用霍夫圆检测定位液滴，使用SSD 和Faster RCNN能够实现多尺寸的液滴检测，输出的预测框边长更接近标签中液滴的直径，使用异常点过滤模块还能有效的避免阴性液滴的误检。Filter Faster R-CNN的预测性能与Filter SSD相近，且能够有效去除图片中的异常斑点，但Filter SSD对于部分边缘不清晰的液滴存在漏检的情况。在少尘的环境下，Filter Faster R-CNN的精确率、阳性微滴准确率和F1分数均优于其他ddPCR检测算法。而在多尘的环境中，改进后的网络召回率下降了0.04%，这是由少量阳性微滴被误判为异常点导致，但相对的，阳性微滴准确率大幅提升，从61.08%提升至88.35%。相比其他ddPCR 检测算法，Filter Faster RCNN能够实现最佳预测性能，这反映了本文模型能够很好的抑制灰尘对ddPCR检测引入的影响。

通过对Filter SSD和Filter Faster R-CNN与未添加过滤模块的原网络预测性能进行t检验显示，在少尘环境中二者检测性能相同，不具有统计学意义，而在多尘环境中，过滤模块的召回率相同，阳性准确率的差异具有统计学意义，这很好地证明过滤模块能够抑制异常点误检带来的影响，从而提升了模型对低浓度样本的检测性能。

本文还测试了SSD、Filter SSD、Faster R-CNN 和Filter Faster R-CNN对实际样本的检测性能。在多组实验预测结果绘制的相关回归线中，Filter Faster RCNN得到了更大的决定系数，预测结果与标准浓度高度一致，且检测结果中没有离群值。相比SSD，过滤模块与Faster R-CNN 相结合后检测性能更好，这是由SSD漏检了部分液滴导致。ddPCR检测实验说明过滤模块能够有效的解决预测过程中异常点带来的影响，体现了较强的抗干扰能力，可以降低ddPCR实验对无尘环境的依赖，减少实验对芯片设计的要求，为实现低成本的ddPCR检测提供一个新的思路。

使用本文模型预测液滴时，对采集ddPCR图片的曝光时间具有较严格的要求。摄像头的曝光时间要求在1～1.2 s之间，若曝光时间超出范围会增加液滴的错误分类的风险，未来准备在预处理环节进一步调节图像的对比度，从而减少曝光时间对网络预测的影响。此外本文采集的ddPCR图片轮廓相对清晰，图片内光照条件相对均匀，噪声较少，后续研究将使用低分辨率摄像头替代荧光显微镜采集ddPCR图像，进一步实现设备的低成本化。届时图片中会引入更多噪声信号，这会为后续工作带来一定挑战。

综上所述，本研究设计一种高通量、稳定和准确的ddPCR液滴检测技术，通过将Faster R-CNN与异常点过滤模块结合，有效的解决了ddPCR图片中灰尘、划痕等因素带来的影响。本研究通过收集了不同浓度样本试剂的ddPCR图片，建立了一个数据集，凭借芯片材质将图片区分为少尘环境和多尘环境，并在霍夫圆变换的辅助下完成图片标注。本文比较了Filter Faster RCNN与其他检测算法在不同环境下的性能差异，并将网络对样本试剂的检测结果与流式检测设备的检测结果进行了比较。最终证明Filter Faster R-CNN在有尘环境中，能够准确识别阴性与阳性液滴，且检测结果与商业化设备给出的标准浓度一致，是一种准确、可靠的ddPCR检测方式。