受体结合苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶3及其抑制剂的研究进展

陈 迪,罗秀菊,彭 军

(1.中南大学湘雅药学院药理学系,湖南 长沙 410078; 2. 中南大学湘雅三医院检验科,湖南 长沙 410013)

在机体的生长发育中往往伴随着细胞的生理性和病理性死亡,因此细胞死亡对机体的发育及形态维持具有重要意义。细胞死亡形式有多种,其中研究最透彻的主要有2种,即凋亡和坏死。凋亡是细胞的一种主动死亡形式,受到信号通路严格调控,表现为细胞膜皱缩、染色质固缩、核膜核仁破裂和凋亡小体形成,其中核DNA断裂是细胞凋亡的主要特征之一。坏死是细胞受到意外伤害或刺激后发生的一种被动死亡形式,表现为膜通透性增高、细胞肿胀、细胞器变形或肿大直至细胞破裂。长期以来,人们普遍认为坏死不受信号通路调控,但已有大量研究表明,部分坏死也是受调控的,称为调节性坏死。根据调控信号通路的不同,调节性坏死可分为坏死样凋亡、焦亡、铁死亡、亲环素D依赖性坏死等,其中坏死样凋亡是目前研究的热点之一。作为介导坏死样凋亡信号通路中的关键分子,受体结合苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶3(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3,RIPK3)已成为当前研究的热点分子。随着研究的不断深入,人们发现RIPK3不仅参与坏死样凋亡,还参与了凋亡和细胞焦亡的发生,成为了多种细胞死亡通路中交叉重叠的关键分子(Fig 1)。本文旨在对RIPK3及其抑制剂的研究进展作一综述。

Fig 1 Involvement of RIPK3 in necroptosis, apoptosis and pyroptosis

1 RIPK3的生物学特点

RIPK3是RIP激酶家族的7个成员之一,是一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,具有与其他RIP激酶相似的N-末端激酶结构域和一个独特的C端RIP同源相互作用结构域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)[1]。1999年,研究人员首次发现RIPK3,该基因位于人类和小鼠的14号染色体上,在人类中编码一个含518个氨基酸的蛋白,分子量为57 ku,在小鼠中编码一个含486个氨基酸的蛋白,分子量为53 ku[2]。

在细胞内,RIPK3主要位于细胞质,但也可作为核质穿梭蛋白在细胞核和细胞质之间进行转移。而在人体组织中,RIPK3广泛表达,且在心脏、肠、肾、肺、胰腺和脾脏中的表达水平要明显高于肝脏和肌肉组织[3]。

2 RIPK3与坏死样凋亡

坏死样凋亡因其既具有坏死的形态学特征又像凋亡一样受到信号通路严格调控而得名, 其中受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3 和混合谱系激酶结构域样蛋白( mixed-lineage kinase domain-like pseudokinase,MLKL)是介导坏死样凋亡的主要分子。

研究表明,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的坏死样凋亡中,肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)招募肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TNF receptor associated death domain,TRADD)、RIPK1、TNF受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)和细胞凋亡蛋白抑制因子1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein 1 and 2,cIAP1/2)形成复合体Ⅰ。随后复合体Ⅰ从膜上释放到胞质中,当caspase-8活性受到抑制时,其中的RIPK1与RIPK3通过RHIM结合形成坏死小体。经过磷酸化修饰后,坏死小体会招募其下游的效应蛋白MLKL,使MLKL发生寡聚并异位至细胞膜,最终导致细胞膜破裂[4]。但MLKL是如何导致质膜破裂的,仍是目前的研究热点。此外,有报道称Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA binding protein 1,ZBP1)也能通过其RHIM结构域与RIPK3结合而激活RIPK3,进而介导MLKL的活化,发生RIPK3激酶依坏死样凋亡与多种疾病的发生发展密切相关,包括心肌梗死、脑卒中、神经退行性疾病、肿瘤等。作为介导坏死样凋亡的关键蛋白,开发靶向抑制RIPK3的药物可为临床相关疾病的治疗提供思路。

赖性的坏死样凋亡[5]。另有研究报道,Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)诱导的坏死样凋亡通过β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)的RHIM与RIPK3形成异质装配体而激活TRIF-RIPK3-MLKL途径[6]。

3 RIPK3与凋亡

细胞凋亡是细胞内的预存死亡程序,是一种稳态的非炎症过程,主要包括三条信号转导途径：内源性途径(又称线粒体凋亡途径)、外源性途径(又称死亡受体凋亡途径)和内质网途径。Caspases是细胞凋亡中的一类重要的凋亡蛋白酶,凋亡的过程实际就是Caspases被活化并发生凋亡蛋白酶的级联反应的过程。在促凋亡的Caspases中,Caspase-2,-8,-9,-10是细胞凋亡的启动者,参与凋亡的起始;Caspase-3,-6,-7则是细胞凋亡的效应者,执行细胞的凋亡程序。

RIPK3不仅是坏死样凋亡中的重要分子,同样也参与凋亡的进程。早期研究表明,无激酶活性的RIPK3 D161N不发生坏死样凋亡,反而促进RIPK1和Caspase-8依赖性的细胞凋亡[7]。在这两条平行途径中,与坏死样凋亡不同的是,RIPK3诱导的凋亡不依赖于其激酶活性,但RIPK1却是其中的关键分子,它的作用是连接RIPK3和Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)、Caspase-8。RIPK3二聚化后,不会发生磷酸化,在RIPK1的作用下通过RIPK1/RIPK3/FADD/Caspase-8通路激活Caspase-8,最终使Caspase-3活化而发生凋亡[8]。

由于凋亡和坏死样凋亡有重叠的分子机制,所以人们认为坏死样凋亡是细胞的一种备用程序性死亡,可在受Caspase调控的凋亡途径被抑制时启动细胞的死亡。而关于两种死亡方式的先后顺序,有人认为凋亡和坏死样凋亡是相互排斥的,也有人认为二者原则上可以同时进行。

4 RIPK3与细胞焦亡

细胞焦亡,又称细胞炎性死亡,是一种促炎的程序性细胞死亡方式。与引起非炎症反应的细胞凋亡不同,细胞焦亡也依赖于Caspases,但同时伴有大量促炎因子释放,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应。目前研究发现,细胞焦亡主要有三条途径：依赖于Caspase-1的经典途径、依赖于Caspase-4/5/11的非经典途径和凋亡相关的Caspase参与的途径。

Caspase-1是细胞焦亡中的一个重要蛋白,它参与炎症小体的形成,对Gasdermin-D进行切割,促进IL-1β和IL-18的成熟,最后诱发细胞的死亡。然而有研究表明,Caspase-1也可以RIPK3依赖的方式激活。RIPK3抑制剂HG-9-91-01与RIPK3相互作用后招募RIPK1,激活Caspases,最终导致Gasdermin-E裂解,从而引发RIPK3-RIPK1-Caspase-1-Caspase-8诱导的细胞焦亡[9]。在脂多糖诱导的巨噬细胞和树突状细胞中,使用凋亡抑制剂蛋白的拮抗剂或基因缺失后,RIPK3依赖的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)-Caspase-1和Caspase-8这两个通路的激活均可促进IL-1β前体的成熟和分泌,从而引发炎症反应,但RIPK3是如何作用于Caspase-8的目前尚不清楚[10]。然而,在Yersinia中,转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)抑制的情况下Caspase-8会诱导Gasdermin-D和Gasdermin-E的裂解,从而抑制凋亡、促进焦亡的发生[11]。因此,RIPK3可能通过Caspase-1和Caspase-8这两个通路的激活参与细胞焦亡的发生。

细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性等的发生发展,对细胞焦亡的深入研究有助于为临床防治提供新思路。因此,RIPK3通过Caspase-1和Caspase-8诱发细胞焦亡或将成为一个新靶点,但三者之间的关系还有待进一步阐明。

5 RIPK3介导的组织器官损伤

RIPK3参与介导炎症和多种细胞死亡形式(包括坏死样凋亡、凋亡和细胞焦亡)。TNFR1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体、Fas受体、TLR3/4、干扰素受体1、ZBP1等的激活均可使RIPK3激活,从而导致细胞死亡和炎症的发生[12]。

由于RIPK3在机体各组织中广泛分布,其与肝损伤、缺血性肾损伤、心肌缺血/再灌注损伤、脑缺血/再灌注损伤等多种组织器官的损伤密切相关。2015年研究人员发现,NKT细胞中RIPK3的激活可促使磷酸甘油酸变位酶5激活,再通过发动蛋白相关蛋白1和活化T细胞核因子诱导急性肝损伤,而RIPK3-/-小鼠的肝损伤却显著降低[3]。近期有研究表明,在急性肾损伤期间RIPK3的表达增加,而RIPK3的缺乏会减少叶酸诱导的急性肾损伤中炎症介质的释放[13]。同时在心肌缺血/再灌注中,RIPK3的表达增加会导致心脏重塑,使AMP依赖的蛋白激酶/Parkin介导的线粒体自噬丧失,最终导致线粒体通透性转换孔的开放增加,从而引发坏死样凋亡[14]。而在脑缺血/再灌注模型中,脑缺血会迅速激活RIPK3依赖的坏死样凋亡,同时使TAK1减少促进凋亡的发生,而RIPK3的缺乏可减少脑出血的风险[15]。此外,小鼠创伤性脑损伤后皮质和海马会发生进行性慢性脑损伤,并伴随着pMLKL的升高,坏死样凋亡的增加;而RIPK3缺陷小鼠可显著减少这种慢性脑损伤,使星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少,从而发挥神经保护作用[16]。

6 RIPK3抑制剂

如前所述,RIPK3涉及多种损伤相关性疾病的发生发展,故靶向抑制RIPK3有助于减轻损伤和炎症,从而保护组织器官。根据激酶结合模式,可把RIPK3抑制剂分为Ⅰ型、Ⅱ型和其它类型[12](Tab 1)。

Tab 1 Classification of RIPK3 inhibitors

6.1 Ⅰ型抑制剂通过靶向激酶的活性DFG-in构象,Ⅰ型抑制剂包括Dabrafenib和GSK′843。Dabrafenib最初是用于黑色素瘤的治疗,但后来发现它还是一种有效的RIPK3抑制剂,小鼠腹腔注射Dabrafenib后可显著减小脑梗死体积,降低TNF-α水平[17]。GSK′843可与RIPK3的激酶结构域结合而抑制激酶活性,从而以浓度依赖性的方式抑制坏死样凋亡,但在高浓度时也会激活caspase发生凋亡[18]。

6.2 Ⅱ型抑制剂靶向激酶的DFG-out构象,Ⅱ型抑制剂包括Sorafenib、Ponatinib、HS-1371、GSK′067、GSK′074。Martens等[19]发现抗癌药Sorafenib可以靶向TNF-α诱导的坏死样凋亡通路,在低浓度时可与RIPK1和RIPK3结合而抑制激酶活性,干预坏死小体的形成,但在高浓度时有细胞毒性。抗白血病药Ponatinib可阻断TNF-α诱导的坏死样凋亡中MLKL的磷酸化,其直接靶点是RIPK1、RIPK3和TAK1,可有效抑制细胞死亡[20]。此外,HS-1371是筛选出的一种RIPK3抑制剂,它可与RIPK3结合抑制激酶活性,干扰坏死小体的形成,从而抑制坏死样凋亡,但由于凋亡不依赖于RIPK3的激酶活性,所以它不会抑制凋亡,相反,它们的结合可能会引起RIPK3构象的改变从而诱导细胞凋亡[21-22]。GSK′074和GSK′067是两种结构和细胞功能均相似的化合物,Zhou等[23]发现二者对RIPK1和RIPK3有双重抑制作用,从而抑制坏死样凋亡,且细胞毒性低,在高浓度时不会引起细胞凋亡。

6.3 其他除上述两种类型的抑制剂外,还有许多其他的抑制剂,其中包括RIPK3的经典抑制剂GSK′872。与GSK′843一样,GSK′840和GSK′872也可与RIPK3的激酶结构域结合而抑制其激酶活性,然而这两种抑制剂在高浓度时均具有较大的细胞毒性[18]。Rodriguez D A等筛选出的抑制剂GW′39B的结构核心与GSK′872非常相似,可以阻断RIPK3介导的MLKL在小鼠和人细胞中的磷酸化,从而抑制MLKL的寡聚化,但高浓度时是否存在细胞毒性还有待确认[24]。从ZINC数据库中筛选出的三种化合物ZINC71828321、ZINC72474191和ZINC72454060具有与RIPK3结合的能力而抑制RIPK3,在体外也表现出对缺血后的神经保护作用[25]。

最近,一个新的小分子化合物Zharp-99也显示出对RIPK3有抑制作用,可有效阻断死亡受体和Toll样受体配体诱导的坏死样凋亡,且这个小分子显示出良好的体外安全性和体内药动学参数[26],有望成为新的坏死样凋亡抑制剂。AZ-628也可作为一种潜在的RIPK3抑制剂减弱RIPK3的激酶活性,减少RIPK3介导的骨关节炎的发病机制,同时其细胞毒性也较低[22]。此外,SIKs抑制剂HG-9-91-01也在近期被发现可直接靶向RIPK3激酶活性,抑制RIPK3与下游MLKL的结合,减少MLKL的寡聚,从而抑制坏死样凋亡,然而HG-9-91-01也被发现会诱导细胞焦亡[9]。在HT-29细胞中,Raf激酶抑制剂TAK-632及其类似物SZM594 通过抑制RIPK1和RIPK3的磷酸化来阻断坏死小体的形成,同时也会抑制RIPK3和MLKL之间的相互作用,且SZM594对坏死样凋亡的阻断作用比已知的经典RIPK3抑制剂更有效[27]。随后Bcr-Abl抑制剂GNF-7也被发现可以抑制RIPK1和RIPK3的磷酸化而抑制坏死小体的形成[28]。SRC抑制剂PP2可抑制坏死样凋亡而不触发细胞凋亡,它通过影响RIPK3的寡聚而影响MLKL的磷酸化和寡聚化[29]。

虽然针对RIPK3抑制剂的开发在不断进行,但目前仍没有一种RIPK3抑制剂被临床选择用于治疗与RIPK3相关的疾病。高剂量药物的细胞毒性限制了这些抑制剂作为治疗药物的潜力,因此开发更安全有效的RIPK3抑制剂仍在进行中。

7 结语

综上所述,RIPK3在细胞死亡中发挥着重要的作用,它既可启动激酶依赖性的坏死样凋亡,也可参与不依赖于激酶活性的Caspase-8介导的凋亡和焦亡,而这些死亡方式之间往往是协同调控的。如TAK1和ZBP1可共同参与调控RIPK3和Caspase-8,调节RIPK1/RIPK3-FADD-Caspase-8细胞死亡复合体的组装,执行坏死样凋亡、细胞凋亡和细胞焦亡[30]。此外,由于RIPK3是Caspase-8蛋白水解酶的底物,而Caspase-8是几种细胞死亡方式的分子开关,可在细胞死亡信号发出后控制坏死样凋亡、细胞凋亡和焦亡信号通路,决定其所触发的死亡类型。因此,作为多种细胞死亡方式的交汇点,RIPK3有可能成为精准调控细胞死亡方式的靶点。在目前已知的RIPK3抑制剂中,虽然部分已用于临床,但并非通过抑制RIPK3用于疾病治疗。虽然通过靶向调节RIPK3用于相关疾病的治疗还有相当长的路要走,但并不能否定其广阔的临床前景。