藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老

周颖东,张梦娴,王青玲,康浩然,张治成,王庆林,刘亚敏,郭向东

(1.河南中医药大学第一临床医学院, 河南 郑州 450046;2.河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科, 河南 郑州 450000;3.河南医学高等专科学校, 河南 郑州 451191;4.河南中医药大学药学院,河南 郑州 450046)

老年性聋是伴随着衰老而出现的感音神经性听力损失,其主要病理改变包括：内耳毛细胞丢失、螺旋神经节细胞丢失、血管纹萎缩以及听觉中枢退化[1]。中枢性老年性聋是由听觉中枢退化引起的听力损失,主要临床表现包括在嘈杂环境中理解语言、定位声源和处理声音信息的能力下降,并且会增加认知能力下降和患阿尔茨海默病的风险[2]。中医认为耳与脑相通,肾精通过脑髓来滋养耳,而气血瘀滞阻塞耳与脑连接的通道是导致耳聋的病因,因此,中医常使用活血化瘀的方药治疗耳聋。当归具有养血调肝以行滞的功效,而川芎具有行气开郁、活血止痛的功效,当归与川芎也在众多治疗耳聋的方药中多次出现[3],藁本内酯(ligustilide, LIG)是当归、川芎的共同活性成分之一,被发现具有抗炎、抗氧化应激和抗凋亡等药理学活性,并对多种神经系统疾病如缺血性脑卒中、阿尔茨海默病和神经性疼痛具有明显的治疗效应[4]。然而,LIG是否是治疗中枢性老年性聋的活性成分还有待研究。

铁死亡是一种在形态、生化和基因上有别于凋亡、坏死的全新的细胞程序性死亡方式。Fe2+在细胞内蓄积,产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)消耗细胞内抗氧化物质,并介导脂质过氧化,诱导细胞死亡[5]。有研究发现,在D-半乳糖诱导的衰老大鼠听皮层神经元中铁死亡被激活,说明铁死亡参与中枢性老年性聋的发病机制,表明干预铁死亡可能成为中枢性老年性聋新的治疗靶点[6],然而,该研究尚停留在初步探索阶段。铁自噬是一种依赖于核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)的选择性自噬,NCOA4同时结合铁蛋白与微管相关蛋白轻3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3),将铁蛋白转运到自噬-溶酶体降解,并释放出Fe2+来调控细胞内游离铁含量[7]。过度激活的铁自噬可使细胞内游离铁水平升高,促进铁死亡,而抑制铁自噬水平能够延缓细胞铁死亡[8]。最近的研究发现,铁自噬在衰老小鼠的大脑皮层与海马内被激活,并且可能参与衰老听皮层铁死亡的过程[9]。LIG可通过阻断铁自噬过程进而抑制铁死亡,减轻氧糖剥夺再灌注的PC12细胞损伤[10]。因此,LIG在小鼠听皮层内是否也发挥抑制铁自噬与铁死亡的作用,从而保护听皮层神经元、延缓中枢性老年性聋,值得通过实验来验证。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级13月龄C57BL/6J雄鼠40只,同品系2月龄雄鼠10只,购自于江苏集萃药康生物科技股份有限公司,许可证编号： SYXK(豫)2021-0015。所有小鼠均饲养于清洁级动物房,饲养环境无噪声。实验已通过河南中医药大学伦理委员会审批。

1.2 实验药品与试剂LIG(批号： L8862691)购自上海麦克林试剂公司;DAPI溶液(批号： C0060)、伊红染色液(批号： G1108)、Mayer苏木精染液(批号： G1080)、BCA蛋白质浓度检测检测试剂盒(批号： PC0020),购自北京Solarbio公司;普鲁士蓝染液(批号： G1029)、DAB显色液(批号： G1212-200T)、GAPDH(批号： GB12002),购自武汉Servicebio公司;NCOA4 (批号： DF4255)、长链脂酰辅酶A合成酶4 (Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4) (批号： DF12141);谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase, GPX4) (批号： DF6701),购自美国affinity公司;LC3B(批号： 18725-1-AP)、HRP标记的羊抗兔IgG(批号： SA00001-0),购自美国Proteintech公司。

1.3 实验仪器和设备电泳仪(DYY-6D,北京六一生物科技有限公司)、电泳槽(DYCZ-24DH,北京六一生物科技有限公司);凝胶成像分析仪(WD9413C,北京六一公司);激光共聚焦显微镜(NIKON Eclipse Ti,上海尼康仪器有限公司);听性脑干反应仪系统(TDT RZ6/BioSigRZ,美国Inteligent Hearing Smart公司);酶标检测仪(Epoch,美国BioTeK公司);透射电子显微镜(HT7800/HT7700,日本hitachi公司)。

1.4 方法

1.4.1动物分组与给药 自然衰老且听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测示听阈值明显升高的13月龄小鼠作为中枢性老年性聋模型,随机分为LIG低剂量组(L-LIG组)、LIG中剂量组(M-LIG组)、LIG高剂量组(H-LIG组)和衰老组(Age组),2月龄小鼠作为对照组(Ctrl组),LIG组分别按10、20、40 mg·kg-1浓度腹腔注射LIG,Age组腹腔注射等量生理盐水,每天1次,连续给药4周。

1.4.2ABR检测给药前后小鼠听阈值 腹腔注射戊巴比妥钠 (40 mg·kg-1) 麻醉后将记录电极置于小鼠颅顶正中点皮下,参考电极置于左耳耳后皮下,耳机对准左耳外耳道,地线接右耳耳后皮下,刺激声为短纯音(15 ms刺激音,1 ms间歇),叠加1 024次记录ABR波形,从90 dB开始,5 dB递减,直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激强度作为听阈值。

1.4.3血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测 麻醉小鼠后,摘取眼球取血,全血离心取上清液迅速转移至-80 ℃冰箱保存,使用全自动生化分析仪检测血清SOD活力与MDA含量。

1.4.4听皮层组织病理学染色 冰上取脑,多聚甲醛中固定,根据小鼠脑解剖图谱[11]确定听皮层组织所在节段,冠状面切开,石蜡包埋,切片(厚度4 μm)备用。经烤片,脱蜡,至水,苏木精-伊红(HE)染色,脱水,透明,封片后,在显微镜下观察,参照图谱确定听皮层所在区域,观察并拍摄。

1.4.5透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察铁死亡情况 冰上分离听皮层组织并切成1 mm小块,于电镜固定液中4 ℃固定过夜,1%锇酸固定2 h,经梯度浓度酒精脱水,EMBed-812包埋,醋酸铀与枸橼酸铅双重染色并超薄切片(60～80 nm),TEM下观察并拍摄。

1.4.6DAB加强法普鲁士蓝染色观察听皮层组织铁沉积 取听皮层石蜡切片,烤片、脱蜡,至水,参照试剂盒说明书进行普鲁士蓝染色。DAB显色,苏木素染色,分化,返蓝,脱水,透明,封片,显微镜观察听皮并拍摄。

1.4.7免疫荧光染色观察听皮层组织LC3B与NCOA4共定位 取听皮层石蜡切片,烤片、脱蜡,至水,柠檬酸钠抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,BSA封闭, LC3B(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,次日依次孵育HRP标记的二抗、CY3-TSA,再次进行抗原修复,NCOA4(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,孵育FITC二抗,DAPI复染细胞核,自发荧光淬灭剂,抗荧光淬灭封片剂封片激光共聚焦显微镜下观察并拍摄。

1.4.8Western blot检测铁死亡与铁自噬相关蛋白表达 听皮层组冰上裂解,离心取上清液,参照 BCA 试剂盒说明书检测总蛋白质浓度。变性,制胶,上样(20 μg蛋白质),转膜,封闭,加入一抗NCOA4、ACSL4、GPX4、 GAPDH(1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜。次日加入二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h,ECL超敏发光液显色曝光,使用ImageJ软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 LIG对衰老小鼠的听阈值的影响如Fig 1所示,与Ctrl组相比,治疗前各组小鼠听阈均明显上升(P<0.01)。治疗后,Age组小鼠听阈值进一步升高(P<0.01),与Age组相比,M-LIG组和H-LIG组小鼠听阈值明显降低(P<0.01),且H-LIG组最明显,L-LIG组听阈值无统计学意义。

Fig 1 Auditory threshold shift of mice in each groupbefore and after n=10)

2.2 LIG对小鼠血清中MDA含量与SOD活力的影响如Tab 1所示,与Ctrl组相比,Age组小鼠血清MDA含量升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01)。与Age组相比,L-LIG组和M-LIG组小鼠血清MDA含量与SOD活性无明显差异,H-LIG组小鼠血清MDA含量降低(P<0.05),SOD活力无明显差异。

Tab 1 Serum MDA content and SOD activity of mice in each

2.3 LIG对衰老小鼠听皮层病理学影响如Fig 2所示,HE染色发现,Ctrl组听皮层中神经元结构完整、排列整齐、细胞形态饱满、核染色清晰;而Age组小鼠听皮层神经元数量减少、排列疏松、细胞体积缩小,大量变性的神经元核固缩深染;与Age组相比,L-LIG组、M-LIG组和H-LIG组神经元数量增多、变性的神经元减少、核固缩现象减少。

Fig 2 Morphology of auditory cortex of mouse in each group(×200)

2.4 LIG对衰老小鼠听皮层细胞超微结构的影响如Fig 3所示,TEM观察发现,Ctrl组细胞形状规则,细胞膜结构清晰,胞核规则,染色质分布均匀,双层核膜清晰,细胞器数量适中,线粒体形状结构规则。Age组表现出衰老典型改变,胞质局部溶解,胞核不规则,局部内陷,粗面内质网扩张,自噬结构增多,观察到衰老的线粒体(肿胀,基质局部溶解空泡化,线粒体嵴断裂缩短)和铁死亡特征性线粒体(体积变小,膜破损,膜内基质密度变深,嵴减少)。L-LIG组、M-LIG组和H-LIG组未见铁死亡特征性线粒体改变,胞内可见脂褐素。在L-LIG组观察到趋于凋亡的细胞,胞体略显固缩,胞浆密度略深,胞核异型,线粒体明显肿胀,严重者空泡变,粗面内质网扩张明显,局部脱颗粒。相比于Age组,M-LIG组细胞衰老改变稍轻,H-LIG组细胞衰老改变最轻。

2.5 LIG对衰老小鼠听皮层铁沉积的影响如Fig 4所示,Ctrl组听皮层组织铁沉积较少,铁主要集中在细胞外毛细血管内。Age组听皮层组织可见明显铁沉积,铁聚集颗粒细胞(呈黄棕色或黄褐色)数量明显增多。与Age组相比,M-LIG组和H-LIG组铁聚集颗粒细胞数量减少,以H-LIG组减少最明显。

2.6 LIG对衰老小鼠听皮层组织铁自噬的影响如Fig 5所示,激光共聚焦显微镜观察发现,相比于Ctrl组,Age组观察到部分神经元轴突与胞体内发生NCOA4和LC3B共定位,表明发生了铁自噬。L-LIG组和M-LIG组也观察到了共定位现象但程度较Age组轻,而H-LIG组罕见。

Fig 4 DAB enhanced prussian blue iron staining of auditory cortex in each group(×400)

Fig 5 Possible colocalization of NCOA4 and LC3B detected by immunofluorescence(×1 000)

2.7 LIG对衰老小鼠听皮层组织铁死亡与铁自噬相关蛋白表达水平的影响如Fig 6所示,与对照组相比,Age组听皮层组织GPX4表达明显减少(P<0.01),ACSL4、NCOA4、表达明显升高(P<0.01)。与Age组相比,M-LIG、H-LIG组GPX4表达升高(P<0.05),ACSL4、NCOA4表达降低(P<0.01),且H-LIG组最明显,L-LIG组差异无统计学意义。

Fig 6 Comparison of related protein expression in auditory cortex of mice in each

3 讨论

目前对中枢性老年性聋的研究主要集中在线粒体功能障碍、ROS生成异常、氧化应激、线粒体DNA突变和神经细胞凋亡[12]。本研究与以往研究结果一致,衰老小鼠听阈值明显上升,血清MDA含量明显升高、SOD活性降低,并且衰老小鼠听皮层神经元数量减少、排列疏松、细胞体积缩小,大量变性的神经元核固缩深染,这些结果均符合中枢性老年性聋特征。LIG干预后能有效改善衰老小鼠听功能,有效延缓听皮层衰老损伤,且浓度越高疗效越明显,说明LIG能对中枢性老年性聋具有治疗作用。

铁死亡的特征性表现为线粒体体积的缩小,双层膜密度增加、线粒体嵴减少或消失[13]。本研究通过TEM观察到衰老听皮层神经元发生铁死亡特异性线粒体改变,证实铁死亡参与听皮层神经元衰老过程,而LIG干预能够改善线粒体损伤。在分子层面,铁死亡受转运蛋白、酶等多种信号通路的调节。细胞内Fe2+蓄积或氧化还原相关酶的调节异常,都会导致细胞内产生大量ROS并发生脂质过氧化,最终通过多种途径激活铁死亡[14]。衰老小鼠听皮层神经元内铁含量升高,铁聚集颗粒细胞数量明显增多,LIG以剂量依赖性的方式减少铁聚集颗粒细胞数量。GPX4是细胞中催化脂质过氧化产物还原的主要酶,可以对抗脂质过氧化产物的细胞毒性,维持细胞脂质双层膜结构的稳定性,然而,随着铁死亡过程中谷胱甘肽的耗竭,GPX4的活性发生不可逆抑制。细胞膜表面多不饱和脂肪酸在ACSL4催化下与磷脂结合,形成磷脂化多不饱和脂肪酸,随后,在花生四烯酸脂氧合酶催化下产生脂质过氧化产物[15]。作为脂代谢中重要的酶,ACSL4在铁死亡过程中升高[16]。结果显示,衰老小鼠听皮层组GPX4的表达水平明显降低、ACSL4的表达水平明显升高,LIG干预能升高GPX4并降低ACSL4的表达水平,并且随着LIG的浓度的升高,效果越明显。

既往研究表明,抑制NCOA4介导的铁自噬通过降低游离铁浓度抑制铁死亡[17],并且,在衰老小鼠的大脑皮层与海马内,NCOA4的表达水平明显升高[9]。与之前的研究一致,通过免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下观察到NCOA4与LC3存在空间共定位,提示NCOA4与LC3发生相互作用,听皮层神经元发生铁自噬。Western blot结果也显示,与对照组相比,NCOA4的表达水平明显升高,提示铁自噬在听皮层激活,并且NCOA4的表达水平随LIG浓度的升高而降低,说明LIG可能是通过抑制铁自噬发挥铁死亡抑制作用的。

综上所述,LIG能够通过下调听皮层神经元铁自噬,抑制铁死亡,延缓听皮层组织衰老,改善中枢性老年性聋小鼠的听功能,因此调节铁自噬可作为中枢性老年性聋潜在的治疗靶点。