基于PINK1-Parkin线粒体自噬通路探讨海昆肾喜含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用

孙妍华,季 敬, 彭 娇, 何 珊,, 付先军

(1.山东中医药大学药学院,2.海洋中药研究中心,山东省高等学校海洋中药重点实验室,山东中医药组学工程技术研究中心,山东中医药大学,山东 济南 250355)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种起病隐匿、进行性发展,伴随着学习、记忆和认知能力严重下降的慢性中枢神经系统退行性疾病。AD的发病机制尚不完全清楚,目前主要的病理特征是脑内聚集的淀粉样蛋白-β(amyloid β-protein,Aβ)多肽组成的淀粉样斑块,以及过度磷酸化的Tau蛋白组成的神经原纤维缠结,另一个早期和突出特征是线粒体的结构和功能受损[1]。线粒体自噬作为清除受损线粒体的主要途径,与AD的发病进程存在着密切联系。增强线粒体自噬可以保持线粒体的质量和功能,抑制Aβ和Tau蛋白的聚集,并逆转认知缺陷,提示靶向线粒体自噬可能是AD治疗的重要途径[2]。特别是,PINK1-Parkin信号通路是介导线粒体自噬的重要途径,在调节线粒体功能完整性中发挥重要作用[3]。

相关研究表明,一些具有化浊/祛瘀作用的中药可以增强线粒体自噬,促进Aβ的清除,抑制Tau蛋白的过度磷酸化,从而达到治疗AD的效果,如中药提取物三七皂苷[4]、复方当归芍药散[5]等。海昆肾喜(haikun shenxi,HKSX)的有效成分为昆布中提取的褐藻多糖硫酸酯(fucoidan,FPS),是主要由α-L-岩藻糖-4-硫酸酯形成的水溶性杂多糖,具有化浊排毒之效。从中医药角度分析,HKSX善利水化痰,适用于癥瘕痰瘀胶结之证,推测其可以调节线粒体自噬干预AD。

课题组前期动物实验表明,HKSX能够调节自噬,改善SAMP8小鼠学习和认知障碍[6],但是否与线粒体自噬相关尚不明确。转染人APP695Swedish突变基因的N2a/App695细胞,可以自身产生淀粉样蛋白Aβ沉积,为国际认可的AD细胞模型,为了进一步探讨HKSX干预AD的作用机制,我们以N2a/APP695细胞为模型,探索HKSX含药血清在细胞水平的神经保护功能及线粒体自噬相关的作用机制,并通过抑制剂Mdivi-1抑制线粒体自噬,进一步验证PINK1-Parkin介导的线粒体自噬通路是否在HKSX干预AD中发挥关键性作用。

1 材料与仪器

1.1 细胞株与动物小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞、转染人APP695Swedish突变基因的N2a/App695细胞,均由厦门大学孟健老师赠予。

24只SPF级雄性SD大鼠,体质量220±20 g,购自于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2021-0006,动物实验设施许可证编号：SYXK(鲁)20220009。本研究中涉及动物的实验均经山东中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理号SDUTCM20230331001)。

1.2 药物与主要实验试剂HKSX胶囊购自于长龙生化药业股份有限公司(货号015221007);高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)硅胶板购自Millipore Sigma(货号105554);Aβ1-42ELISA试剂盒购自上海酶联生物(货号m1002201);β-actin(货号4967)、PINK1(货号6946)、Parkin(货号2132)、LC3(货号2775)、p62(货号5114)购自CST公司;Tau[EPR2731](phospho S396)(货号ab109390)购自于Abcam;辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号ZB-2301)购自中杉金桥;ATP检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒购自碧云天生物(货号S0026、C2006);活性氧(ROS)测定试剂盒购自南京建成(货号E004-1-1);线粒体自噬抑制剂Mdivi-1购自Millipore Sigma(货号M0199-5MG)。

1.3 主要实验仪器酶标仪(Bio Tek,Epoch2)、全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能,Tanon 4800Multi)、高级正置荧光显微镜(蔡司,Axio Examiner.A1)、微孔板恒温振荡器(杭州佑宁仪器有限公司,WZ80-2)。

2 方法

2.1 HKSX含药血清制备24只SD大鼠适应性喂养一周后,按随机数字法分为4组：空白血清组、HKSX低剂量组(L)、HKSX中剂量组(M)、HKSX高剂量组(H)。HKSX灌胃剂量按照成人(60 kg)与大鼠体表面积折算的等效剂量比值为6.2进行换算,计算出低、中、高剂量大鼠的灌胃剂量分别为0.15、0.3、0.6 g·kg-1,空白血清组大鼠给予相同体积的蒸馏水,灌胃持续7 d,每天2次。末次给药1 h后,经10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉取血。取血后,血液常温静置0.5 h,3 000 r·min-1离心15 min,取上层血清,56 ℃水浴灭活30 min,经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,将同组大鼠的血清合并后分装于2 mL的冻存管,于-80 ℃保存备用。

2.2 HKSX含药血清中糖类成分的HPTLC分析HKSX中FPS的多糖重均分子量为96.9 ku,这一分子量的多糖类成分以原型入血的可能性极小,因此通过HPTLC对HKSX含药血清的糖类成分进行分析。将HKSX、空白血清、含药血清样品点样于HPTLC硅胶板[7],用正丙醇 ∶水 ∶氨水(50 ∶25 ∶2.4)展开2次,苯胺-二苯胺显色。

2.3 细胞培养与给药将N2a细胞复苏后培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中,N2a/App695细胞复苏后培养于含终浓度为0.2 g·L-1G418的N2a细胞完全培养基中,置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

取对数生长期的细胞按一定的密度铺板,在37 ℃、5%CO2培养箱孵育24 h后,进行分组给药。N2a细胞(正常对照组,NC)、N2a/App695细胞分为模型对照(MC)组、HKSX低中高3个剂量组,NC组和MC组给予15%的空白血清[8],HKSX给药组分别给予15%的低、中、高剂量含药血清。在研究线粒体自噬抑制剂的影响时,增加一个H+M-1组,即提前给予25 μmol·L-1Mdivi-1[9]干预2 h,再给予HKSX含药血清,所有组别给药24 h后,进行如下指标检测。

2.4 MTT法检测含药血清对细胞增殖的影响取对数生长期的N2a、N2a/App695细胞接种于96孔板中,每孔5×103个细胞,设6个复孔。给药结束后,在避光条件下向每孔中加入20 μL MTT试剂(5 g·L-1)[4],4 h取出,吸弃各孔的培养基,并加入150 μL DMSO,置于37 ℃微孔板恒温振荡器中振荡10 min,使结晶物充分融解,用酶标仪测量490 nm处各孔的A值。

2.5 ELISA检测Aβ1-42的表达将N2a、N2a/APP695细胞按3×108L-1的密度接种于6孔板中,给药结束后,吸出上清液,按试剂盒说明书测定Aβ1-42的含量[6],下层细胞用裂解液裂解,BCA测定蛋白浓度,单位以每克蛋白质中Aβ1-42的含量计算。

2.6 线粒体功能检测

2.6.1JC-1法检测线粒体膜电位 细胞按3×108L-1的密度接种于直径为3.5 cm的小皿中,给药结束后,每孔加入1 mL JC-1染色工作液,置于细胞培养箱中孵育,按照试剂盒说明书[9]在荧光显微镜激发光490 nm、发射光530 nm处检测JC-1单体绿色荧光,激发光525 nm、发射光590 nm处检测JC-1聚合体红色荧光。在正常情况下,线粒体膜电位较高,JC-1为聚合物呈红色荧光;而在线粒体膜电位水平降低时,JC-1形成单体产生绿色荧光,通过绿色到红色荧光的转变,指示线粒体膜电位的恢复程度。

2.6.2DCFH-DA法检测ROS 细胞按3×108L-1的密度接种于6孔板中,给药结束后,每孔加入1 mL DCFH-DA探针溶液,37 ℃培养箱中孵育,按照试剂盒说明书在激发波长488 nm,发射波长525 nm检测条件,用荧光酶标仪进行检测,结果以各组浓度/正常对照组平均浓度(fold chang)表示。

2.6.3ATP检测 细胞按3×108L-1的密度接种于6孔板中,给药结束后,吸弃上清,PBS清洗后加入裂解液,置于冰上充分裂解,离心取上清。按试剂盒说明书向检测孔中加入100 μL ATP检测工作液,室温放置5 min,再分别加入20 μL标准品和样品,迅速用枪混匀,用化学发光酶标仪检测,根据标准曲线计算样品中的ATP浓度,结果以各组浓度/正常对照组平均浓度(fold change)表示。

2.7 Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白的表达细胞按3×108L-1的密度接种于6孔板中,给药结束后,吸弃上清,用预冷的PBS轻洗3次,每孔加入150 μL裂解液,置于冰上裂解15 min,用刮刀刮至一侧,吸至EP管中,4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min取上清,用BCA试剂盒检测蛋白浓度,调至统一浓度后,加入5× Loading Buffer 混匀,金属浴96 ℃、10 min进行蛋白变性。

配制丙烯酰胺凝胶,每孔上样30 μg[5],按80 V 30 min,120 V 60 min 进行电泳;甲醇激活PVDF膜,260 mA转膜2 h,用5%脱脂奶粉室温封闭3 h,按1 ∶1 000稀释β-actin、PINK1、Parkin、LC3、p62、p-Tau S396一抗,4℃摇床孵育过夜;次日,将膜用TBST洗5次,每次5 min,室温孵二抗2 h,用TBST洗5次,每次5 min,配制显影液,用凝胶成像仪成像分析。

3 结果

Fig 1 HPTLC chart of carbohydrate componentsin HKSX medicated serum

3.2 HKSX含药血清对N2a/App695细胞活力无影响如Fig 2所示,通过MTT检测HKSX含药血清对细胞的毒性,与NC组相比,15%的HKSX低、中、高3个剂量的含药血清对细胞活力均无明显影响,表明HKSX含药血清无细胞毒性,可以进行后续实验。

Fig 2 Effect of HKSX medicated serum

3.3 HKSX含药血清能够降低N2a/App695细胞中Aβ1-42的沉积ELISA实验显示,与NC组相比,MC组细胞Aβ1-42水平明显升高(P<0.01),给予HKSX含药血清干预后,Aβ1-42的水平呈剂量依赖性下降,高剂量组的清除效果尤为明显(P<0.01),见Fig 3。结果表明,HKSX能够清除Aβ1-42在神经细胞中的沉积,降低其神经毒性的损伤,发挥神经保护作用。

Fig 3 HKSX medicated serum reduced level of Aβ1-42

3.4 HKSX含药血清改善N2a/App695细胞的线粒体功能AD发生时常伴随着线粒体功能障碍,如Fig 4A所示,与NC组相比,MC组绿色荧光明显,表明线粒体膜电位Δψm降低,而HKSX含药血清处理后,红色荧光明显增多,表明线粒体膜电位Δψm明显升高。此外,如Fig 4B-C所示,MC组ROS水平明显升高以及ATP含量降低,HKSX处理后可以降低ROS水平并明显提高ATP的含量,以高剂量组疗效更为明显(P<0.01),说明HKSX含药血清能够改善线粒体功能障碍。

Fig 4 HKSX medicated serum improved mitochondrial

3.5 HKSX含药血清调节线粒体自噬相关蛋白表达通过Western blot检测PINK1-Parkin线粒体自噬通路中相关蛋白的表达水平,结果如Fig 5所示,与NC组相比,MC组PINK1、Parkin及LC3II的表达明显降低,而p62表达量明显升高;HKSX含药血清给药处理后,与MC组相比,PINK1、Parkin及LC3Ⅱ的表达提升,同时下调p62水平,以高剂量组效果明显。这表明通过HKSX含药血清的干预,能够剂量依赖性激活线粒体自噬,加快对磷酸化Tau蛋白的清除,减弱其神经毒性,改善神经功能。

3.6 线粒体自噬抑制剂Mdivi-1对HKSX神经保护作用的影响

Fig 5 HKSX medicated serum regulated expression of mitophagy-related proteins and reduced expression of p-Tau Ser396 protein in N2a/App695

3.6.1线粒体自噬抑制剂干扰了HKSX对p-Tau蛋白的清除 由Fig 6可以看出,与HKSX组相比,HKSX+Mdivi-1组PINK1、Parkin蛋白表达明显降低(P<0.01),说明加入Mdivi-1后,PINK1/Parkin通路确实受到了抑制。与此同时,Tau蛋白Ser396位点的磷酸化程度增多(P<0.01),这一结果表明,HKSX对p-TauSer396的清除作用与PINK1-Parkin通路密切相关。

Fig 6 Mitophagy inhibitor inhibited clearance of p-Tau Ser396 protein by

3.6.2线粒体自噬抑制剂干扰了HKSX对Aβ1-42的降低 ELISA结果同样显示,与H-HKSX组相比,加入线粒体自噬抑制剂Mdivi-1后,再给予高剂量含药血清,Aβ1-42水平明显升高(P<0.01),见Fig 7,表明HKSX主要是通过线粒体自噬途径清除Aβ1-42在神经细胞中的沉积,降低其神经毒性的损伤,从而起到防治AD的效果。

Fig 7 Mitophagy inhibitor inhibited clearance of Aβ1-42

4 讨论

大量研究表明,AD患者大脑中普遍存在线粒体异常,线粒体形态和功能障碍是神经元细胞损伤和积累的重要因素。神经元内受损的线粒体主要通过线粒体自噬途径进行清理,是线粒体质量控制的重要机制,在维持神经细胞的功能、保护脑内神经元细胞和神经信号的传导中发挥着重要作用[10]。

PINK1-Parkin信号通路是介导线粒体自噬的重要途径,在调节线粒体功能完整性中发挥重要作用[3]。线粒体受损时,PINK1大量聚集于线粒体外膜,积累并招募Parkin,继而对线粒体外膜的蛋白进行泛素化,诱导线粒体自噬,随后,包括p62在内的受体蛋白在线粒体外膜上积累,导致泛素化的产物与LC3结合被招募到自噬体中,成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,受损的线粒体就能够被降解[2]。在AD样本中,PINK1的表达量降低,其介导的线粒体自噬受阻,小鼠表现出Aβ积聚的增加,线粒体的异常,学习记忆功能和突触可塑性的损伤;而提高PINK1的表达可以降低Aβ的水平,改善线粒体功能,缓解认知功能损害[11]。所以,PINK1-Parkin信号通路的调控对于减轻AD中神经元损伤十分重要,是神经保护作用的关键机制之一。

AD 属中医“呆病”、“健忘”、“善忘”等范畴,是一种与年龄关系最为密切的神经退行性疾病,“浊毒损脑”是其中医病机的重要方面。机体衰老,肾气虚衰,肾虚水无所主,脾虚不运水湿,湿聚生痰浊,痰扰清灵则昏蒙呆钝。如清·唐容川《血证论》云：“凡心有瘀血,亦令健忘”,《类证治裁》云：“若血瘀于内,而善忘如狂。所以,瘀浊痰是AD发病中最常见的病邪。中医认为精微滞留蓄积而为浊,细胞中衰老的细胞器、错误合成或折叠错误的蛋白质,都属于中医的内生痰浊、瘀血之邪,是中医痰瘀在细胞微观层面上的体现[12]。AD的病理标志物Aβ沉积、过度磷酸化的Tau蛋白,包括受损的线粒体,都可以被看作是人体肾精亏虚,脏腑功能紊乱产生的痰浊瘀血[13]。研究表明,在AD的细胞,转基因动物模型及人类大脑样本中,均观察到线粒体自噬功能受到损伤;而激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,能够及时清除受损线粒体,改善线粒体功能,进而加快对Aβ和磷酸化Tau蛋白等“痰浊瘀血”的清除,逆转AD记忆丧失[14],所以线粒体自噬功能障碍可能为AD“浊毒损脑”的微观机制。

HKSX的有效成分为中药昆布中提取的FPS,研究表明FPS能够通过抗炎、抗氧化、调节胆碱能系统,抑制Aβ的产生及Tau的过度磷酸化,改善AD[15]。其中部分研究发现,FPS可以通过维持线粒体功能来减少神经毒性损伤[16],但是其改善线粒体功能更深入的作用机制是什么?从中医药角度分析,HKSX化浊排毒,善利水化痰,适用于癥瘕痰瘀胶结之证,而线粒体自噬可以通过降解细胞内的受损线粒体,进而清除Aβ及p-Tau等“浊毒”,推测HKSX可以调节PINK1-Parkin介导的线粒体自噬干预AD。

实验结果表明,给予HKSX干预后,能够剂量依赖性地提高N2a/App695细胞中内线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达,激活线粒体自噬,改善细胞线粒体的功能,进而加快神经元细胞内Aβ及p-Tau S396蛋白的清除,减弱其神经毒性,改善神经功能,进而起到防治AD的作用。这些结果表明,HKSX可以通过激活PINK1-Parkin通路调节线粒体自噬,发挥神经保护作用;同时加入线粒体抑制剂后,对Aβ及p-Tau S396的清除能力被抑制,验证了HKSX的神经保护作用与PINK1-Parkin介导的线粒体自噬密切相关。

关于HKSX含药血清通过哪些成分激活线粒体自噬,目前还较难确定。HKSX的有效成分为分子量为96.9 ku 的FPS,这一分子量的多糖类成分以原型入血的可能性极小。Chen等[17]研究表明,FPS在胃内降解为分子量下降,链构象更加灵活的多糖,在肠道中进一步被肠道菌群降解。我们的研究也发现HKSX中的FPS入血后,主要被代谢为单糖或二糖。而且,FPS还可以调节肠道菌群,产生短链脂肪酸,进一步影响宿主代谢[17]。此外,研究亦发现,FPS可以调节胆汁酸,氨基酸等的代谢[18],这个过程比较复杂,后续我们会进行更深入的研究。

综上所述,基于AD、化浊排毒及线粒体自噬三者之间的关系,我们创新性地从线粒体自噬的角度对具有化浊排毒作用的HKSX干预AD的作用及机制进行探讨,在细胞水平探索了HKSX含药血清的神经保护功能及线粒体自噬相关的作用机制。研究结果初步证实了HKSX通过激活PINK1-Parkin通路,增强线粒体自噬,发挥神经保护作用,为其防治AD的临床应用提供科学依据。此外,也在一定程度上探讨了化浊排毒与PINK1-Parkin线粒体自噬通路的关系,以期能够为AD的中医发病机制及其他化浊排毒中药防治AD的作用机制研究提供思路。