基于肠道菌群探讨粗壮女贞总苷对高脂血症金黄仓鼠的降脂作用机制

徐晨曦,潘瑞乐,董梦晨,杨志宏,李晓亚,金 文,杨润梅

[中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中药(天然药物)创新药物研发平台北京市重点实验室,北京 100193 ]

高脂血症又称血脂异常,是指由各种原因导致的血浆中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)及低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)中一种或多种脂质水平升高或高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低的一种代谢性疾病,是动脉粥样硬化和心脑血管疾病的重要危险因素[1]。《中国居民营养与慢性病调查报告(2020)》显示,我国18岁及以上居民高脂血症总体患病率高达35.6%,约5亿人[2]。

引起血脂异常的原因有很多,遗传、不良生活方式和全身性疾病等都会造成疾病的发生。而随着国人生活水平的提升,以高糖、高盐、高脂肪等饮食为代表的不良生活方式成为高脂血症发病的主要原因。现代医学治疗高脂血症的药物主要有他汀、贝特以及烟酸类药物等,长期使用对患者肝脏、肌肉和胃肠道副作用大[3]。中药具有多途径、多靶点、整合调节机体功能的特点[3],从传统中药中开发降脂药物现已成为研究热点。

苦丁茶是我国民间一种应用广泛的纯天然保健饮品,《本草再新》中记载苦丁茶消食化痰,除烦止渴,利二便,去油腻。苦丁茶原植物主要包括两类,一类是以冬青科(Aquifoliaceae)大叶冬青(IlexlatifoliaThunb.)和苦丁茶冬青(llexkudingchaC.J.Tseng)等叶片制作的大叶苦丁茶;另一类是以木犀科(Oleaceae)粗壮女贞[Ligustrumrobustum(Roxb.) Blume]等叶片加工制作的小叶苦丁茶。现代研究证实,粗壮女贞叶具有良好的降脂减肥、降压降糖、抗氧化、保肝护肝、镇痛消炎、抗菌抗病毒、调节肠道菌群等功效[4]。本课题组前期研究发现,粗壮女贞叶降脂活性成分主要为苯丙素苷类化合物,即粗壮女贞总苷(total phenylpropanoid glycosides extracted fromLigustrumrobustum(Roxb.) Blume,LRTPG);并发现LRTPG能够明显降低高脂血症仓鼠的TG、TC、LDL-C水平以及肥胖小鼠的体质量和李氏指数,主要通过激活AMPK-SREBP-1c和JAK/STAT-SREBP1通路,抑制下游脂肪酸和TG合成酶的表达,从而抑制TG合成,并加速胆固醇分解代谢,达到调节脂质代谢的效果[5-7]。

近年来肠道菌群被认为是降脂的新机制,已有大量研究表明,很多具有降脂功效的中药成分如小檗碱、白藜芦醇等具有调节肠道菌群的作用[8]。同时肠道菌群与高脂血症等心脑血管疾病联系密切,其相关性日益受到重视[9]。由此我们在已有研究基础上,以高脂饲料诱导建立金黄仓鼠高脂血症模型,并对模型仓鼠灌胃LRTPG 4周,收集结直肠部位成形粪便,采用16S rDNA 高通量测序技术测定对照组、模型组、LRTPG-H组仓鼠肠道菌群,分析LRTPG对高脂血症仓鼠肠道菌群的影响,基于肠道菌群角度研究LRTPG的降脂作用机制,为粗壮女贞开发降脂药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级叙利亚金黄仓鼠60只,♂,体质量80～110 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0011。金黄仓鼠饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房,使用许可证编号：SYXK(京)2017-0020,昼夜交替光照,温度(25±2)℃,湿度50%～70%。普通饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供,许可证：苏饲证(2019)01008,高脂饲料(15%猪油,0.2%胆固醇,84.8%基础饲料)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号：SCXK(京)2020-0004。

1.2 药物LRTPG是从苦丁茶基原植物粗壮女贞的干燥叶片中提取的总苯丙素苷类物质,由深圳技术大学贺震旦教授课题组制备提供。批号是202109,经HPLC定量分析本批次LRTPG中苯丙素苷类物质含量为87.7%。

1.3 主要试剂和仪器非诺贝特胶囊,法国利博福尼制药公司生产,批号31055;TC测定试剂盒,批号221851;TG测定试剂盒,批号221152;LDL-C测定试剂盒,批号231771;LDL-H测定试剂盒,批号231721,均购于中生北控生物科技股份有限公司。AU480 全自动生化分析系统(中国贝克曼库尔特商贸有限公司),TGL-160aR型高速低温离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 分组及干预方法60只金黄仓鼠适应性喂养3 d后根据体质量随机分为对照组、模型组、阳性药组(非诺贝特50 mg·kg-1)、LRTPG-L组(0.3 g·kg-1)、LRTPG-M组(0.6 g·kg-1)、LRTPG-H组(1.2 g·kg-1),每组10只。对照组仓鼠饲喂基础维持饲料,其他5组仓鼠饲喂高脂饲料,1周后眼球后静脉丛取血检测血脂4项(TG、TC、HDL-C、LDL-C),确定造模成功。根据血脂水平将模型组、阳性药组、LRTPG-L组、LRTPG-M组、LRTPG-H组调整分组,使组间无差异。阳性药组仓鼠灌胃给予浓度为5 g·L-1的非诺贝特水溶液,LRTPG-L组、LRTPG-M组、LRTPG-H组仓鼠分别给予浓度为30 g·L-1、60 g·L-1、120 g·L-1的LRTPG水溶液,灌胃量为10 mL·kg-1,对照组和模型组仓鼠灌胃给予等量的去离子水。每日1次,连续4周。末次灌胃后禁食不禁水12 h,麻醉后眼球后静脉丛取血,用于血脂4项检测,之后颈椎脱臼处死,取肝脏组织及结直肠成形粪便,放入液氮速冻,转移至-80 ℃冰箱保存,用于肝脂检测以及粪便16S rDNA测序。

1.5 观察指标及方法

1.5.1体质量、血脂及肝脂检测 每日观察仓鼠精神状态,每周记录体质量。造模1周后及给药4周后禁食不禁水12 h,眼球后静脉丛取血,分离血清(15 min,7 500 r·min-1,4 ℃),测定血脂含量(TG、TC、HDL-C、LDL-C)。取部分肝脏组织匀浆后取上清,测定肝脏TG、TC含量。

1.5.2肠道微生物数据处理与分析 每组随机挑选6个样品,利用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals,Santa Ana, US)试剂盒提取粪便细菌基因组DNA,根据目标测序区域合成barcode 特异引物,PCR扩增后,采用Qubit荧光定量系统对PCR产物的电泳结果进行定量检测,结合每个样品的测序数量要求和定量结果进行相应比例混合。Paired-end测序在北京奥维森基因科技有限公司的Illumina平台(MiSeq)上完成。为得到高质量的reads,利用内部编写程序去除tags两端的barcode序列及引物序列,运用Usearch (vertion 8.0.1623)软件去除嵌合体及其短序列等后得到clean_tags。拼接过滤后的clean_tags,用QIIME(v1.8.0)软件将其聚类为用于物种分类的操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),根据获得的OTUs进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析及各水平(门、纲、目、科、属)物种组成分析。

2 结果

2.1 LRTPG对高脂血症仓鼠体质量、血脂及肝脂的影响实验期间仓鼠状况良好,大小便及自主活动未见异常,体质量稳定增长。造模1周后,与对照组相比,高脂喂养的5组仓鼠体型肥胖,体质量有所升高,但差异不具有统计学意义(Fig 1A)。造模1周后,与对照组比较,饲喂高脂饲料的模型组、阳性药组、LRTPG-L组、LRTPG-M组、LRTPG-H组仓鼠血清TG、TC和LDL-C水平均明显升高,表明混合型高脂血症模型成功建立(Fig 1B)。给药4周即造模5周后,与对照组比,模型组仓鼠血清TG、TC、LDL-C水平和肝脏TG、TC含量均明显升高;与模型组相比,LRTPG 0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1剂量给药4周能明显降低仓鼠血清TG、TC、LDL-C水平和肝脏TG、TC含量,差异有统计学意义(Fig 1C-D)。

Fig 1 Effects of LRTPG on body weight, blood lipid and liver lipid in hyperlipidemia

2.2 LRTPG对高脂血症仓鼠肠道菌群的影响

2.2.1Shannon-Wiener曲线及物种积累曲线 Shannon-Wiener曲线是反应样本微生物多样性的指数,物种累积曲线是用于描述随着样本量的增加物种种类增多的状况。当曲线的走势趋向平坦时,说明测序的数据量已足够多,可以进行数据分析,能够反映样本中绝大多数的微生物信息。

由Fig 2可知,随着测序深度的增加,本次实验Shannon-Wiener曲线及物种累积曲线趋向平坦,表明实验数据能够反应物种真实性,可进行后续结果分析。

2.2.2OTU及Alpha多样性分析结果 OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度,Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析,基于OTU的结果,分别运用Chao1 index(丰富度指数)、 observed number of species、PD whole tree(丰富度与均匀度指标) 和Shannon index(多样性指数)共4个指数来测算肠道微生物的丰富度和多样性。

Fig 2 Shannon-Wiener curve and Species accumulation curve

结果表明,模型组OTU数量平均值5 521低于对照组平均值6 189,LRTPG-H组OTU数量平均值7 223明显高于模型组;模型组chao1、observed species、PD whole tree、shannon数量低于对照组,LRTPG-H组chao1、observed species、PD whole tree、shannon数量高于模型组。说明高脂血症仓鼠的肠道菌群多样性降低,而给予LRTPG干预后能够改善其肠道菌群的多样性(Fig 3)。

Fig 3 Effects of LRTPG on OTU and alpha diversity of intestinal flora in hamsters

2.2.3Beta多样性分析 主成分分析(principal component analysis,PCA)能够反应样品群落组成的相似程度,样品距离越近则表示物种群落结构越相似。

PCA分析比较不同组别仓鼠肠道菌群结构,结果由Fig 4可知,对照组与模型组菌群结构具有明显差异,表明高脂饮食会造成肠道微生物群落结构发生明显变化。与模型组比较,LRTPG引起了仓鼠肠道微生物群落结构的偏移,表明LRTPG干预改变了仓鼠的肠道菌群组成。

Fig 4 Effect of LRTPG on beta diversity of intestinalflora in hyperlipidemia hamsters

2.3 组间菌群组成及差异分析将对照组、模型组、LRTPG-H组仓鼠结直肠成形粪便中的菌群组成进行分析,结果显示,3组在门水平优势物种相同,但相对丰度不同。门水平上,与对照组相比,模型组厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度由51.4%增加到60%,拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度由45.2%降低到36.4%,厚壁菌门/拟杆菌门升高幅度为44.9%,差异菌群为迷踪菌门(Elusimicrobia)(P<0.05);而与模型组比较,LRTPG组则呈相反趋势,厚壁菌门相对丰度由60%降低到50.6%,拟杆菌门相对丰度由36.4%增加到40%,厚壁菌门/拟杆菌门降低幅度为25.4%,差异菌群为疣微菌门(Verrucomicrobia)(P<0.01)和蓝菌门(Cyanobacteria)(P<0.05)(Fig 5A)。

科水平上,与对照组相比,高脂饮食降低了模型组仓鼠肠道克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、Elusimicrobiaceae的相对丰度,升高了双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、优杆菌科(Eubacteriaceae)的相对丰度;与模型组比较,LRTPG-H组升高了仓鼠肠道克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、疣微菌科 (Verrucomicrobiaceae)相对丰度,降低了乳酸菌科(Lactobacillaceae)相对丰度(Fig 5B)。

属水平组间比较结果显示,与对照组相比,模型组上调厚壁菌门醋杆菌属(Acetobacterium)相对丰度(P<0.01);下调厚壁菌门厌氧菌属(Anaerovorax)(P<0.01)、孢杆菌属(Sporobacter)(P<0.05)、颤杆菌克属(Oscillibacter)(P<0.01)、颤螺菌属(Oscillospira)(P<0.05)、乳头杆菌属(Papillibacter)(P<0.05)、解黄酮菌属(Flavonifractor) (P<0.05)、肠杆菌属(Intestinimonas)(P<0.01)、消化球菌属(Peptococcus)(P<0.01)此8个属的相对丰度;下调变形菌门海旋菌属(Thalassospira)相对丰度(P<0.05),差异菌群共10个。药物干预4周后,与模型组比较,LRTPG-H组逆转了高脂饮食导致的上述厚壁菌门中9个属水平菌群的相对丰度及疣微菌门阿克曼氏菌属(Akkermansia)(P<0.01)的相对丰度变化,下调乳酸菌属(Lactobacillus)(P<0.01)、臭味杆菌属(Odoribacter)(P<0.05)相对丰度以及上调厌氧孢杆菌属(Anaerosporobacter)(P<0.05)的相对丰度,差异菌群共13个(Fig 5C-D)。

Fig 5 Effect of LRTPG on intestinal flora of hyperlipidemia hamsters

3 讨论

本研究结果显示,给予高脂饮食5周的模型组金黄仓鼠血清TG、TC、LDL-C水平及肝脏TG、TC含量均明显高于对照组,表明高脂饮食能够诱导仓鼠高脂血症以及肝脏脂质蓄积的发生。而给予LRTPG干预4周后,仓鼠血清TG、TC、LDL-C水平及肝脏TG、TC含量明显降低,表明LRTPG具有较好的降脂功效,与课题组前期研究结果一致[5-6]。

肠道菌群是生物体肠道功能的重要组成部分,参与调控宿主的多种代谢途径。近年来许多研究表明,肠道菌群与高脂血症之间也有着千丝万缕的联系。肠道菌群失衡会使机体糖类、脂肪等代谢紊乱,造成高脂血症的发生[10]。本研究采用16S rDNA高通量测序技术测定高脂血症模型仓鼠肠道菌群,分析LRTPG对高脂血症仓鼠肠道微生物群落的影响。研究结果发现高脂饮食造成模型组仓鼠肠道菌群OTU及Alpha多样性降低,而给予LRTPG后发生逆转,提示LRTPG能够改善高脂血症模型仓鼠肠道菌群紊乱状态,增加其肠道微生物的多样性,使其向更为健康的方向发展。

测序结果显示,与对照组比较,随着高脂血症的发生,模型组金黄仓鼠肠道厚壁菌门相对丰度升高,拟杆菌门、疣微菌门相对丰度降低,厚壁菌门/拟杆菌门比值升高;LRTPG干预后,与模型组比较上述菌群相对丰度趋势发生了逆转。有研究表明,肠道菌群占比最大的厚壁菌与拟杆菌是对血脂变化影响最大的主要菌门。厚壁菌门具有分解肠道饱和脂肪酸和调控宿主增强脂肪积累的功效,过量的能量摄入会导致厚壁菌门大量繁殖,造成肠道菌群失调以及肥胖的发生[10];而拟杆菌门则能够通过降解饮食中的多糖,增加短链脂肪酸水平,调控宿主的能量和脂肪代谢[11],许多研究认为厚壁菌门/拟杆菌门比值与肥胖呈负相关[10]。结合本研究结果,提示LRTPG可能通过调节肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的比例发挥降脂作用。而且我们还发现LRTPG给药前后菌群丰度差异最显著的是疣微菌门,已被证实疣微菌门有助于维持肠道屏障稳态,其丰度降低与肥胖、糖尿病、脂肪肝等多种代谢性疾病密切相关[12]。

研究证实,克里斯滕森菌科、瘤胃球菌科、消化球菌科、疣微菌科相对丰度与宿主体质量指数(body mass index,BMI)、血清TG水平呈负相关[8, 12-14]。瘤胃球菌科颤螺菌属在瘦人中富集,与儿童和成人BMI下降相关,已被作为候选的益生菌之一[14]。Liu等[15]对中国人群进行随机化分析,结果显示喜树科颤杆菌克属相对丰度的增加与甘油三酯水平、BMI、腰臀比的降低呈因果关系;梭菌科解黄酮菌属是肠道健康的重要菌群,其含量与肥胖呈负相关[16];疣微菌科阿克曼氏菌属Akkermansiamuciniphila菌是一种潜在的益生菌,在肠道黏液层中生长,通过与结肠上皮细胞Toll受体结合及调节紧密连接蛋白的表达等来维持肠道稳态,可通过调节脂肪合成相关基因和肝脏不同炎症性标志物的表达,进而改善高脂饮食诱导的高脂血症、肥胖、胰岛素抵抗和肠道炎症等疾病[12, 17]。本研究结果显示,LRTPG干预后,在科水平上可升高高脂血症仓鼠肠道菌群中克里斯滕森菌科、消化球菌科、疣微菌科相对丰度,在属水平上明显升高颤螺菌属、颤杆菌克属、解黄酮菌属和阿克曼氏菌属的相对丰度。进一步说明LRTPG对高脂血症仓鼠的降脂作用与其对肠道菌群的调节密切相关。

综上所述,LRTPG能够降低高脂饮食导致的金黄仓鼠血清脂质升高和减轻肝脏脂质蓄积,具有较好的降低血脂、肝脂作用,并且能够改善高脂血症金黄仓鼠肠道菌群紊乱状态,调节厚壁菌门、拟杆菌门恢复至正常丰度,增加有益于降脂减肥的疣微菌门阿克曼氏菌属、厚壁菌门颤螺菌属、颤杆菌克属、解黄酮菌属相对丰度,从肠道菌群角度阐释了LRTPG的降脂作用,为LRTPG开发降脂药物提供参考。然而LRTPG对肠道菌群的调节作用在其治疗高脂血症作用中的贡献度、以及总苷如何影响肠道菌群代谢物等都有待进一步研究。