柚皮素下调RIP1-RIP3-MLKL信号通路抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡

吕向阳,任晓爽,张 良,许继群

(1. 山东中医药大学附属医院生殖遗传科,山东 济南 250011;2. 山东第一医科大学附属济南妇幼保健院妇女保健科,山东 济南 250001)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种持续无排卵性内分泌疾病。近来大量研究证实,胰岛素抵抗、激素分泌紊乱、炎症及氧化应激,均可损伤卵巢颗粒细胞,导致PCOS患者卵巢卵泡发育不良及无排卵症状的发生[1]。卵泡颗粒细胞为卵母细胞的发育提供营养和生长调节剂,卵泡颗粒细胞凋亡会使卵泡生长延迟,在PCOS的发病机制中起重要作用[2]。坏死性凋亡,也叫做程序性坏死,其失调是许多炎症性疾病的关键因素。最近的1项研究显示,PCOS相关的颗粒细胞中多种差异基因与细胞凋亡和坏死性凋亡途径有关[3]。受体相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)、RIP3和混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like proteins,MLKL)是参与调节坏死性凋亡的主要分子,RIP1可与其家族蛋白RIP3相互作用,形成坏死复合体,介导坏死性凋亡信号的传导及转化,参与细胞死亡过程[4]。已有文献研究发现,RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡参与癌症、脑损伤、心脏损伤等多种疾病的发展[5]。然而,RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡是否也参与PCOS颗粒细胞凋亡过程,尚未见报道。

柚皮素是合成雌激素的天然替代物之一,其具有较好的抗炎、抗氧化应激、改善性激素分泌紊乱、缓解卵巢颗粒细胞层减少等作用[6],提示柚皮素可能是治疗PCOS的潜在药物。但柚皮素抗卵巢颗粒细胞减少的作用是否与RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径有关,未见报道。本研究通过建立大鼠PCOS模型对此进行探究验证,以期阐明柚皮素抗PCOS颗粒细胞凋亡的分子机制,并为其开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SD大鼠,SPF级,♀,体质量200～210 g,6～7周龄,购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[动物生产许可证号：SCXK(吉)2020-0002]。大鼠于山东中医药大学动物实验中心饲养[动物使用许可证号：SYXK(鲁)2022-0009],实验经山东中医药大学动物伦理委员会批准：IACUC-01(20200327),符合3R原则。

1.2 试剂柚皮素(货号：SND-675,规格：20 mg),购自滁州仕诺达生物科技有限公司;脱氢表雄酮(货号：30099087),购自深圳海思安生物技术有限公司;RIP1特异性抑制剂Nec-1(货号：LM4359),购自上海联迈生物工程有限公司;RIP1-RIP3-MLKL坏死信号激活剂(caspase-8抑制剂Z-VAD-fmk,货号：MBS842218-C),购自艾美捷科技有限公司;大鼠白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)ELISA试剂盒(货号：MS23245)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA试剂盒(货号：MS35245),均购自北京博沃尔斯生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(货号：E-CK-A211),购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;抗体RIP1、磷酸化RIP1(p-RIP1)、RIP3、磷酸化RIP3(p-RIP3)、MLKL、磷酸化MLKL(p-MLKL),均购自美国Abcam公司。

1.3 仪器BX-51型光学显微镜(日本Olympus公司);iMark680多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司);FACScan流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

1.4 方法

1.4.1模型建立及分组 SD大鼠参照文献[7]方法,于颈背部皮下注射脱氢表雄酮(脱氢表雄酮溶于注射用油剂,30 mg·kg-1,2 mL·kg-1,每天1次,连续4周),建立PCOS模型(以第10周检查取阴道涂片,出现角化细胞、动情周期不完整,并出现血清睾酮水平异常升高,视为造模成功)。大鼠随机分为：模型组、柚皮素组(100 mg·kg-1)、Nec-1组、Z-VAD-fmk组、柚皮素+Z-VAD-fmk组,每组15只;另取SD大鼠在相同部位于相同时间注射油剂2 mL·kg-1,作为正常对照组。

柚皮素组参照文献[6]灌胃给予柚皮素(100 mg·kg-1,10 mL·kg-1,每天1次,连续7 d);Nec-1组参照文献[8]经腹腔注射给予RIP1特异性抑制剂Nec-1(6 mg·kg-1,每天1次,连续7 d);Z-VAD-fmk组参照文献[9]经尾静脉注射caspase-8抑制剂Z-VAD-fmk(1.5 mg·kg-1,每天1次,连续7 d);柚皮素+Z-VAD-fmk组灌胃给予柚皮素(100 mg·kg-1)的同时,尾静脉注射给予Z-VAD-fmk进行治疗;模型及正常对照组灌胃给予10 mL·kg-1生理盐水。

1.4.2流式细胞术测卵巢颗粒细胞坏死率及凋亡率 随机取5只各组大鼠,处死,取左右卵巢组织,参照文献[10]中操作方法,分离并收集卵巢组织中的颗粒细胞,制成卵巢颗粒细胞液,取2×106个细胞,按Annexin V-FITC/PI双染液说明书方法,染色孵育后,流式上机检测细胞死亡方式,并计算坏死率及凋亡率。

1.4.3HE染色观察卵巢形态 断头处死大鼠,取左右卵巢组织,左侧卵巢制成厚20 μm的冰冻切片,取相同部位切片,复温、水化后行HE染色,光镜下观察卵巢组织颗粒细胞及卵泡细胞形态变化。右侧卵巢组织置于液氮中保存备用。

1.4.4免疫组化法检测卵巢组织p-RIP1阳性表达 相同卵巢组织冰冻切片,复温、水化、透化处理后,滴加1 ∶200的p-RIP1一抗孵育过夜,生物素标记的IgG二抗孵育50 min,DAB显色及苏木精复染后,光镜下观察拍照,Image-Pro Plus 6.0软件检测单位面积内,p-RIP1阳性染色的平均光密度值。

1.4.5ELISA法检测卵巢组织炎症因子IL-1β、TNF-α水平 取液氮中保存的卵巢组织,解冻、剪碎、匀浆后取匀浆液,ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α水平。

1.4.6Western blot法检测蛋白表达 液氮中保存的卵巢组织,解冻、剪碎,组织裂解液裂解及冰上研磨,提取匀浆液中蛋白,BCA法检测蛋白总浓度,用50 μg蛋白行电泳、电转膜操作。孵育盒中滴加1 ∶1 000稀释的RIP1、p-RIP1、caspase-8、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL一抗,以及1 ∶2 000稀释的β-actin内参抗体孵育24 h,再与二抗室温孵育2 h,化学发光液显色、曝光,Alpha Ease FC软件计算蛋白条带相对灰度值。

1.4.7统计学分析 表示符合正态分布的数据,SPSS 21.0统计软件分析数据,单因素方差分析及SNK-q检验行多组间比较及组间多重比较。

2 结果

2.1 柚皮素对大鼠卵巢组织病理形态的影响由Fig 1的HE染色可见,正常对照组大鼠卵巢组织卵泡、卵母细胞正常,颗粒细胞层数为8～12层;模型组卵巢组织可见卵泡囊性扩张、卵泡闭锁且内无卵母细胞,颗粒细胞层减少等病理损伤严重;柚皮素组及Nec-1组大鼠卵泡颗粒细胞层增多,闭锁卵泡减少;Z-VAD-fmk组大鼠卵泡囊性扩张、卵泡闭锁,颗粒细胞层减少最严重;柚皮素+Z-VAD-fmk组上述病理损伤较柚皮素组严重,较Z-VAD-fmk组有明显改善。

Fig 1 HE staining of ovarian tissue of rats in each group(×40)

2.2 柚皮素对大鼠卵巢颗粒细胞坏死率及凋亡率的影响流式检测图中,象限(Q2+Q4)总和为凋亡细胞数目,Q1象限为坏死细胞数目,Q3为生存细胞数目。如Fig 2所示,与正常对照组相比,模型组大鼠卵巢颗粒细胞坏死率、凋亡率升高(P<0.01)。与模型组相比,柚皮素组、Nec-1组大鼠卵巢颗粒细胞坏死率、凋亡率降低(P<0.01),柚皮素组对卵巢颗粒细胞坏死率、凋亡率降低作用优于Nec-1组;Z-VAD-fmk组大鼠凋亡率较模型组降低(P<0.05),坏死率较模型组进一步升高(P<0.05)。与柚皮素组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠凋亡率降低(P<0.05),坏死率升高(P<0.01);与Z-VAD-fmk组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠卵巢颗粒细胞坏死率、凋亡率降低(P<0.01)。

Fig 2 Annexin V-FITC/PI double staining used to detect apoptosis rate and necrosisrate of ovarian granulosa cells in each

2.3 柚皮素对大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平的影响如Fig 3所示,与正常对照组相比,模型组大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)。与模型组相比,柚皮素组、Nec-1组大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01),柚皮素组对卵巢组织IL-1β、TNF-α水平降低作用优于Nec-1组;Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平较模型组升高(P<0.01)。与柚皮素组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01);与Z-VAD-fmk组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01)。

Fig 3 Comparison of levels of inflammatory factors (IL-1β, TNF-α) in ovarian

2.4 柚皮素对大鼠卵巢组织p-RIP1阳性表达的影响免疫组化染色显示(Fig 4),p-RIP1在正常对照组大鼠卵巢颗粒细胞层中呈弱阳性表达,在模型组卵巢颗粒细胞层中呈强阳性(红棕色)表达,模型组大鼠卵巢组织颗粒细胞中p-RIP1阳性表达高于正常对照组(P<0.01)。与模型组相比,柚皮素组、Nec-1组大鼠p-RIP1阳性表达降低(P<0.01),柚皮素组p-RIP1阳性表达降低强度优于Nec-1组。Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织p-RIP1阳性表达较模型组升高(P<0.01)。与柚皮素组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织p-RIP1阳性表达升高(P<0.01);与Z-VAD-fmk组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠卵巢组织p-RIP1阳性表达降低(P<0.01)。

Fig 4 p-RIP1 immunohistochemical staining of rat ovariantissue and comparison of positive expression

2.5 柚皮素对大鼠RIP1-RIP3-MLKL坏死途径相关蛋白表达的影响如Fig 5所示,与正常对照组相比,模型组大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL升高(P<0.01)。与模型组相比,柚皮素组、Nec-1组大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL降低,柚皮素组对坏死途径相关蛋白的降低作用优于Nec-1组。Z-VAD-fmk组大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值较模型组进一步升高(P<0.01)。柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值高于柚皮素组;与Z-VAD-fmk组相比,柚皮素+Z-VAD-fmk组大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值降低(P<0.01)。

Fig 5 Expression of p-RIP1/RIP1, p-RIP3/RIP3 andp-MLKL/MLKL in rat ovarian

3 讨论

卵巢颗粒细胞为卵泡内的大细胞群,可为卵泡发育提供营养,并维持性激素的分泌[2]。PCOS患者血糖、血脂、性激素分泌紊乱、胰岛素抵抗、炎症刺激,均可诱导卵巢颗粒细胞老化、凋亡,从而阻滞小窦卵泡发育,导致PCOS排卵异常并影响生育[11]。Zhang等[12]研究发现,PCOS患者卵泡液、颗粒细胞中存在IL-1β、TNF-α炎性因子及睾酮水平升高现象,并认为睾酮水平可能诱导炎症细胞向卵泡液、颗粒细胞趋化而诱导卵巢颗粒细胞凋亡。本研究发现,模型组大鼠卵巢中闭锁卵泡增多,颗粒细胞减少,卵巢颗粒细胞凋亡率、坏死率均升高,卵巢组织中炎症因子(IL-1β、TNF-α)水平均高于正常对照组,提示PCOS大鼠出现炎症、颗粒细胞凋亡、坏死现象,表明造模成功。柚皮素为二氢黄酮类成分,其具有较好的降糖、降脂、抗炎、抗凋亡及抗氧化应激、降低胰岛素抵抗等作用[13]。Hong等[14]发现,柚皮素可缓解PCOS大鼠卵巢颗粒细胞层减少等病理损伤。本研究发现,柚皮素在缓解PCOS大鼠颗粒细胞减少、卵泡闭锁等病理损伤的同时,还降低卵巢颗粒细胞坏死率及凋亡率,抑制卵巢炎症因子(IL-1β、TNF-α)分泌,证实柚皮素可能为防治PCOS颗粒细胞凋亡的潜在药物。然而,柚皮素促进PCOS卵巢颗粒细胞生存的信号调节机制,还不明确。

坏死性凋亡不同于凋亡和其他形式的程序性细胞坏死,其不依赖于caspase活性,但需要RIP3调控的MLKL磷酸化,MLKL的磷酸化使MLKL在质膜上产生孔复合体,从而导致损伤相关分子模式的分泌、细胞肿胀和膜破裂[15]。RIP1是调控坏死性凋亡的关键蛋白,在炎症、凋亡、感染、应激等条件下,RIP1的K117、K627、K377位点去泛素化修饰,可促进RIP1发生自身磷酸化活化,而启动死亡、凋亡及存活等信号的传导及传递[16]。已有研究发现,磷酸化的RIP1可诱导RIP3发生自身磷酸化,并与其结合形成坏死小体,激活MLKL,使MLKL磷酸化形成寡聚体,来破坏细胞完整性,介导细胞坏死性凋亡的产生[17]。本研究发现,PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中p-RIP1阳性表达异常升高,其下游RIP3和MLKL的磷酸化水平均增加,表明PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中RIP1-RIP3-MLKL途径处于活化状态。提示RIP1-RIP3-MLKL途径的激活可能是介导PCOS大鼠颗粒细胞坏死性凋亡的可能机制。

RIP1的特异性抑制剂Nec-1可抑制RIP1去泛素化修饰,阻断RIP1磷酸化激活,抑制RIP1-RIP3-MLKL坏死小体形成介导的坏死性凋亡的发生,促进细胞存活。本研究用RIP1特异性抑制剂Nec-1阻断PCOS大鼠卵巢组织中RIP1磷酸化活化后,RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径被抑制,卵巢颗粒细胞坏死率、凋亡率均降低,提示阻断颗粒细胞RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径可抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡信号转导,改善PCOS卵巢卵泡及颗粒细胞病理损伤。此外,本研究发现柚皮素抑制RIP1-RIP3-MLKL坏死性凋亡途径活化的作用优于Nec-1,其对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡改善效果最明显,提示柚皮素促进卵巢颗粒细胞存活的作用可能与抑制RIP1-RIP3-MLKL信号转导有关。caspase-8可通过RIP1和RIP3的裂解,抑制坏死性凋亡,如果caspase-8活性被阻断,RIP3即被募集到复合物中,形成坏死小体,引发细胞坏死性凋亡。caspase-8抑制剂Z-VAD-fmk可抑制caspase-8凋亡途径活化,促进细胞向RIP1-RIP3-MLKL坏死性凋亡方向发展。本研究发现,使用Z-VAD-fmk抑制caspase-8活性后,卵巢颗粒细胞凋亡率有所改善,但RIP1-RIP3-MLKL坏死性凋亡途径活化最严重,颗粒细胞坏死率最高,大鼠卵泡闭锁最严重,且caspase-8抑制剂Z-VAD-fmk可部分减弱柚皮素改善PCOS炎症、卵巢颗粒细胞凋亡的作用。提示柚皮素对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用可能是通过阻断RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径实现的。

综上所述,柚皮素可能通过阻断RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径活化,抵抗PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。本研究为柚皮素治疗PCOS提供一定参考,但PCOS卵巢颗粒细胞死亡机制还可能与其他途径有关,柚皮素改善PCOS卵巢损伤,促进颗粒细胞存活的其他机制,还需继续深入研究。